政策法规
猪胸膜肺炎放线杆菌2、7、12型三重PCR定型检测标准
时间:2020-08-27 09:06  浏览:231
  安徽省质量技术监督局《关于下达2018年第一批安徽省地方标准制修订计划的函》(皖质函〔2018〕326号)的要求,由安徽农业大学等单位编制的省地方标准《猪传染性胸膜肺炎放线杆菌2、7、12型三重PCR定型检测技术(征求意见稿)》已完成了起草,现征求各有关单位、专家意见,请提出修改意见,并于2020年9月17日前填写《安徽省地方标准征求意见表》电子版反馈至安徽农业大学,逾期不反馈,视为无意见。E-mail: wangxichun@ahau.edu.cn

更多详情,请登录安徽省市场监督管理局官方网站查询。

节选该标准部分内容:

适用范围

本标准规定了猪胸膜肺炎放线杆菌2、7、12型三重PCR定型检测的设备和材料、分型程序、操作步骤、结果判定。

本标准适用于猪胸膜肺炎放线杆菌2、7、12型三重PCR定型检测。

规范性引用文件

《DB34/T 2997-2017 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌检验操作规程》、《GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法》、《GB 19489 实验室生物安全通用要求》等等。

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌2、7、12型 Actinobacillus pleuropneumoniae types 2, 7, 12

猪胸膜肺炎放线杆菌属于放线杆菌属的一种细菌,根据脂多糖和荚膜多糖的抗原特异性可分为15个血清型,根据生长是否需要 V 因子又可把15个血清型分为生物 Ⅰ 型和生物 Ⅱ 型,生物Ⅰ型通常毒力更强。猪胸膜肺炎放线杆菌 2、7、12 型属于生物 Ⅰ 型,毒力强,危害大。

试剂和材料

除有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯;实验用水符合 GB/T 6682 规定中一级水的要求。所有试剂均用无 DNA 酶污染的容器分装。

2 × Taq PCR Master Mix:Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液等。

引物:扩增引物和测序引物序列见附录 A 表 A.1。

10 × PCR 缓冲液:200 mmoI/L Tris-HCl(pH 8.4),200 mmol/L 氯化钾,15 mmol/L 氯化镁。

琼脂糖凝胶。

10 mg/mL溴化乙锭(EB)。

相对分子质量:2000 bp DNA marker。

5 × TBE 电泳缓冲液:445 mmoI/L Tris,445 mmol/L 硼酸,10 mmol/L EDTA(pH 8.0)。使用时稀释为 0.5 × TBE 电泳缓冲液。

仪器和设备

电热压力蒸汽灭菌器。

电子天平:感量 0.1 g。

恒温震荡培养箱。

冰箱:2℃~5℃,-20℃。

高速冷冻离心机:最大转速14000 r/min以上。

天平:量程 2 kg,感量 0.1 g。

pH计。

涡旋振荡器。

PCR 扩增仪。

电泳仪。

凝胶成像系统。

超净工作台。

微量移液器:0.5 µL~10 µL、5 µL~50 µL、20 µL~200 µL、100 µL~1 000 µL。

血样的采集制备

用注射器无菌操作采集动物血,每头不少于10mL。无菌分离血清,分装,加盖密封后4~8℃保存。

20200826-1124719540  

       图中:

M:DNA Marker 2000;

-:阴性对照;

1:猪传染性胸膜肺炎放线杆菌 2 型;

2:猪传染性胸膜肺炎放线杆菌 7 型;

3:猪传染性胸膜肺炎放线杆菌 12 型;

4:猪传染性胸膜肺炎放线杆菌 2、7、12 型;
 
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