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节选该标准部分内容:
适用范围
本标准规定了猪胸膜肺炎放线杆菌2、7、12型三重PCR定型检测的设备和材料、分型程序、操作步骤、结果判定。
本标准适用于猪胸膜肺炎放线杆菌2、7、12型三重PCR定型检测。
规范性引用文件
《DB34/T 2997-2017 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌检验操作规程》、《GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法》、《GB 19489 实验室生物安全通用要求》等等。
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌2、7、12型 Actinobacillus pleuropneumoniae types 2, 7, 12
猪胸膜肺炎放线杆菌属于放线杆菌属的一种细菌,根据脂多糖和荚膜多糖的抗原特异性可分为15个血清型,根据生长是否需要 V 因子又可把15个血清型分为生物 Ⅰ 型和生物 Ⅱ 型,生物Ⅰ型通常毒力更强。猪胸膜肺炎放线杆菌 2、7、12 型属于生物 Ⅰ 型,毒力强,危害大。
试剂和材料
除有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯;实验用水符合 GB/T 6682 规定中一级水的要求。所有试剂均用无 DNA 酶污染的容器分装。
2 × Taq PCR Master Mix:Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液等。
引物:扩增引物和测序引物序列见附录 A 表 A.1。
10 × PCR 缓冲液:200 mmoI/L Tris-HCl(pH 8.4),200 mmol/L 氯化钾,15 mmol/L 氯化镁。
琼脂糖凝胶。
10 mg/mL溴化乙锭(EB)。
相对分子质量:2000 bp DNA marker。
5 × TBE 电泳缓冲液:445 mmoI/L Tris,445 mmol/L 硼酸,10 mmol/L EDTA(pH 8.0)。使用时稀释为 0.5 × TBE 电泳缓冲液。
仪器和设备
电热压力蒸汽灭菌器。
电子天平:感量 0.1 g。
恒温震荡培养箱。
冰箱:2℃~5℃,-20℃。
高速冷冻离心机:最大转速14000 r/min以上。
天平:量程 2 kg,感量 0.1 g。
pH计。
涡旋振荡器。
PCR 扩增仪。
电泳仪。
凝胶成像系统。
超净工作台。
微量移液器:0.5 µL~10 µL、5 µL~50 µL、20 µL~200 µL、100 µL~1 000 µL。
血样的采集制备
用注射器无菌操作采集动物血,每头不少于10mL。无菌分离血清,分装,加盖密封后4~8℃保存。
图中:
M:DNA Marker 2000;
-:阴性对照;
1:猪传染性胸膜肺炎放线杆菌 2 型;
2:猪传染性胸膜肺炎放线杆菌 7 型;
3:猪传染性胸膜肺炎放线杆菌 12 型;
4:猪传染性胸膜肺炎放线杆菌 2、7、12 型;