本标准规定了鉴定水中灭菌指示微生物的生物学检测方法。本标准适用于经灭菌处置的废水中指示微生物（枯草芽孢杆菌黑色变种）的鉴定。
规范性引用文件
《GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法》、《HJ 494 水质 采样技术指导》、《HJ/T 91 地表水和污水监测技术规范》。
方法原理
灭菌处置后的废水通过孔径为 0.45 μm 的滤膜过滤，细菌和芽孢被截留在滤膜上，然后将滤膜置于酪氨酸选择性培养基上，37℃培养 72 h～96 h，枯草芽孢杆菌黑色变种产生的酪氨酸酶可分解利用酪氨酸形成黑色素，产生黑色的特征菌落。对特征菌落进行染色镜检和生化试验做进一步鉴定，枯草芽孢杆菌黑色变种为革兰氏阳性芽孢杆菌，营养细胞呈杆状，单个或呈短链状排列，芽孢椭圆形，中生，不膨大，能利用甘油、甘露糖，还原硝酸盐，水解淀粉，不能利用苦杏仁苷、甘露醇。根据结果报告检出或未检出枯草芽孢杆菌黑色变种。
采样瓶：具螺旋帽或磨口塞的 500 ml 广口玻璃瓶。
恒温培养箱：允许温度偏差 36℃±1℃。
高压蒸汽灭菌器：121℃可调。
pH 计：准确到 0.1pH 单位，或更高精度。也可使用 pH 比色管或 pH 精密试纸。
显微镜：物镜 10×倍、20×倍、40×倍，油镜 100×倍，目镜 10×倍或 15×倍。
分析天平：感量 0.0001 g。培养皿：直径 90 mm。
过滤装置：配有砂芯滤器和真空泵，抽滤压力勿超过-50kPa。
接种环、镊子。
移液管：1 ml±0.01 ml、10 ml±0.1 ml。也可使用计量合格的可调式移液器。
量筒：100 ml。三角瓶：100 ml。酒精灯。
无菌操作设备：无菌室或超净工作台、生物安全柜。
注：移液管、采样瓶、培养皿、三角瓶等玻璃器皿试验前要按无菌操作要求包扎，高压蒸汽灭菌器（7.3）121℃灭菌 20 min，烘干，备用。
样品采集
点位布设及采样频次按照 HJ/T 494 和 HJ/T 91 的相关规定执行。
采集微生物样品时，采样瓶（7.1）不得用样品洗涤，采集样品于灭菌的采样瓶中。
如果采集的是含有活性氯的样品，需在采样瓶灭菌前加入硫代硫酸钠溶液（6.13），以除去活性氯对细菌的抑制作用（每 125 ml 容积加入 0.1 ml 的硫代硫酸钠溶液）；如果采集的是重金属离子含量较高的样品，则在采样瓶灭菌前加入乙二胺四乙酸二钠溶液（6.14），以消除干扰（每 125 ml 容积加入 0.3 ml 的乙二胺四乙酸二钠溶液）。
注：15.7 mg 硫代硫酸钠（6.11）可去除样品中 1.5 mg 活性氯，硫代硫酸钠用量可根据样品实际活性氯量调整。
培养
用灭菌镊子夹取滤膜移放在酪氨酸琼脂培养基（6.1）上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不得留有气泡，然后用石蜡质封口膜（6.17）封好培养皿，倒置培养皿，放入恒温培养箱（7.2）内，36℃±1℃培养 72 h～96 h。培养 96 h 后，如培养基上未有菌落生长，则试验终止；如培养基上有菌落生长，则挑取黑色的特征菌落于营养琼脂培养基（6.2）上，36℃±1℃培养 24 h，待鉴定。同时将已挑菌落的酪氨酸琼脂培养基培养皿储存于 2℃～5℃，以备必要时复查。
注：菌落颜色无法判断时，可再次划线接种至酪氨酸琼脂培养基（6.1）培养后观察；若菌落为灰色或灰黑色，可适当延长培养时间后观察，培养时间不超过 7d。
挑取可疑菌落（9.3），分别使用革兰氏染色液（6.9）和芽孢染色液（6.10）染色，具体操作及结果观察详见附录 B，若使用市售商品化试剂，则按说明书操作，然后镜检。左——革兰氏染色；右——芽孢染色。图 2 枯草芽孢杆菌黑色变种染色镜检图
生化试验
挑取特征菌落（9.3），分别接种到淀粉培养基（6.3）、硝酸盐培养基（6.4）、甘油复红肉汤培养基（6.5）、甘露糖生化培养基（6.6）、甘露醇生化培养基（6.7）和苦杏仁苷生化培养基（6.8）上，具体操作及结果观察详见附录 B，若使用市售商品化培养基，则按说明书操作。