中国科学院物理研究所等多家单位共同成功研制出国内外首台双光子-STED复合显微镜样机。在“双光子-受激发射损耗(STED)复合显微镜”研究项目上取得重大进步。该项目的核心部件及技术为我国自主研发。对大面阵CMOS相机和长工作距离大数值孔径物镜等部件拥有自主知识产权。填补了我国在该领域的技术空白。

 

　　这国家重点研发计划“数字诊疗装备研发”专项的又一次技术突破！

 

　　双光子荧光显微镜有很多优点：

 

　　1）长波长的光比短波长的光受散射影响较小容易穿透标本；

 

　　2）焦平面外的荧光分子不被激发使较多的激发光可以到达焦平面，使激发光可以穿透更深的标本；

 

　　3）长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小；

 

　　4）使用双光子显微镜观察标本的时候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。所以，双光子显微镜比单光子显微镜更适合用来观察厚标本、更适合用来观察活细胞、或用来进行定点光漂白实验。

 

　　受激发射损耗显微术(STED)是一种有效的光学超分辨方法。通过引入一束损耗光以受激发射的方式来抑制有效荧光的发射，STED可以实现超衍射极限的分辨率。自1994年被提出以来，STED技术经过各方面的改进与发展，正在变得日益的完善与成熟。同时，STED显微术在生物医学、材料学等领域中的多功能应用也推动了这些领域的快速发展。

 

　　延伸阅读：

 

　　双光子显微镜

 

　　概述：

 

　　新型双光子显微镜带有的超高灵敏度的直接探测器能记录组织深层最细微的内部结构。多达7个的外置通道以及光谱拆分软件充分支持多色的多光子实验。再结合高速12kHz扫描头和最大扫描视野，将轴向位移减至最小，有效地收集来自深层组织的微弱光子，使图像更明亮，将对标本的光毒性减至最小。

 

　　基本原理：

 

　　双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。双光子激发的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收2个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有100飞秒，而其频率可以达到80至100兆赫。在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是最高的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦针孔，提高了荧光检测效率。

 

　　受激发射损耗荧光显微术

 

　　概述：

 

　　突破光学衍射极限的办法之一是近场光学显微镜，它是利用探针探测样品表面的隐失场而获得样品表面信息。受激发射损耗荧光显微术是一种可以突破光学衍射极限的远场光学显微术。

 

　　基本原理：

 

　　在常规光学显微系统当中，由于光学元件的衍射效应，平行入射的照明光经过显微物镜聚焦之后在样品上所成的光斑并不是一个理想的点，而是一个具有一定尺寸的衍射斑。在该衍射斑范围之内的样品均会由于被照明光照射而发出荧光，使得该范围内的样品细节信息没有办法被分辨，从而限制了显微系统的分辨能力。为了突破衍射极限的限制，实现超分辨显微，如何减小在单个扫描点处的有效荧光发光面积便成为了关键。

 

　　在STED显微术中，有效荧光发光面积的减小是通过受激发射效应来实现的。一个典型的STED显微系统中需要两束照明光，其中一束为激发光，另外一束为损耗光。当激发光的照射使得其衍射斑范围内的荧光分子被激发，其中的电子跃迁到激发态后，损耗光使得部分处于激发光斑外围的电子以受激发射的方式回到基态，其余位于激发光斑中心的被激发电子则不受损耗光的影响，继续以自发荧光的方式回到基态(如图1所示)。由于在受激发射过程中所发出的荧光和自发荧光的波长及传播方向均不同，因此真正被探测器所接受到的光子均是由位于激发光斑中心部分的荧光样品通过自发荧光方式产生的。由此，有效荧光的发光面积得以减小，从而提高了系统的分辨率。

 

　　STED显微术能实现超分辨的另一个关键在于受激发射与自发荧光相互竞争中的非线性效应。当损耗光照射在激发光斑的边缘位置使得该处样品中的电子发生受激发射作用时，部分电子不可避免地仍然会以自发荧光的方式回到基态。然

 

　　而当损耗光的强度超过某一阈值之后，受激发射过程将出现饱和，此时以受激发射方式回到基态的电子将占绝大多数，而以自发荧光方式回到基态的电子则可以忽略不计。因此，通过增大损耗光的强度，使得激发光斑范围内更多范围的自发荧光被抑制，可以提高STED显微术的分辨率。