【关键词】  HPLC法;辣椒;辣椒碱;正交试验;提取工艺

      

　　Determination of capsaicin by HPLC and optimum extraction process of capsaicin by orthogonal design

      

　　HE Hai-bin，LI Qing-lu，LIN Ru，et al.

　　College of Life Science，Fujian Agriculture and Forestry University，Fu-jian350002，China

    

　　【Abstact】 Objective To establish a HPLC method for determine the content of capsaicin in“Huoremuyuji”and optimized extraction process of capsaicin.Methods The concentration of capsaicin was determined on a Symmetry C18，3.5μm，4.6mm×75mm Column.The mobile phase was methanol-water-phosphoric acid（60:40:0.2）.The detectingwavelength was at280nm.The optimum extraction process was selected with the L9（34）orthogonal de-sign by taking the content of capsaicin as evaluating parameters.Results The capsaicin was determined，the standard curve was linear within the range of（11.2～112）μg/ml（r=0.9993）.The recoveries were within99.9%～102.1%.The conditions of optimum capsaicin extraction by ethanol were:solvent:60%ethanol，three fold;temperature:70℃;time:1hour，extracting three times，The conditions of optimum capsaicin extraction by acid were:solvent:1%hydrochloric acid，one fold;temperature:80℃;time:3hour，extracting three times.Conclusion The method of quantitative determination with HPLC is simple，quick，accurate and suitable for quantitative determination of cap-saicin in capsicum annuum.L and“Huoremuyuji”.The experiments also showed the extraction ratio of capsaicin in60%alcohol was higher than that in1%hydrochloric acid.，but the1%hydrochloric acid extraction process was cheaper and simpler，has a potential application to the industrialized extraction of capsaicin from capsicum annuum.L.

    

　　【Key words】 HPLC;capsicum annuum L;capsaicin;orthogonal design;extraction process

       

　　辣椒（Capsicum annuum.L），属茄科，生长于温带，是人们日常生活中普遍应用的食品辛香调味料。辣椒作为食物调味料已有几个世纪，全世界有1/4的人口日常食用辣椒。其辣味成分可增加唾液分泌淀粉酶且增强其活性，以增进食欲、促进吸收;辣椒作为内服药，可解除胃胀气;作为外用药可用于治疗类风湿病、腰部风湿痛、关节炎、神经痛等疾病。近来还发现其用于水产驱虫有良好的效果。在科研上，辣椒碱被用于研究与P-物质有关的感觉神经传递和镇痛药理过程 ［1，2］ 。

    

　　辣椒中的主要辣味物质是辣椒碱（capsaicin），此外还有二氢辣椒碱、降二氢辣椒碱、去甲辣椒碱等，其中，辣椒碱的含量占辣椒总碱的58%。其化学名为N-［（4-羟基-3-甲氧基苯基）-甲基-（反）-6-壬烯基酰胺，结构式为:

  

　　分子式为C 18 H 27 NO 3 ，分子量305.40，为白色片状晶体，熔点为64.5℃。易溶于甲醇、乙醇、丙酮、氯仿及乙醚中，也可溶于酸性或碱性水溶液中 ［1］ 。

    

　　辣椒碱通常采用乙醇或有机溶剂提取 ［3］ ，以酸性水溶液提取的方法目前国内尚无报道。对辣椒碱的定量测定已报道的方法有比色法 ［4］ ，甲醇-水-柠檬酸为流动相的HPLC法 ［5］ ，乙腈-水-磷酸为流动相的HPLC法等 ［6］ 。本文对采用高效液相色谱法测定辣椒素进行了探讨，通过实验，确定了在十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱上，以甲醇-水-磷酸为流动相，测定辣椒碱的含量。并以辣椒碱含量为提取效果的定量指标筛选出醇提和酸提的最佳提取工艺，并进行比较。

 

　　1 仪器与材料

     

　　1.1 仪器 Waters高效液相色谱仪:Waters1525二元泵;Waters2487紫外检测器;色谱柱:Symmetry十八烷基键合硅胶柱（Waters公司）;超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）;电热恒温水浴锅（上海锦阳光试验仪器有限公司）;万分之一电子分析天平（北京塞多利斯天平有限公司）及其他实验室普通仪器。

    

　　1.2 试剂 辣椒碱对照品（SIGMA公司）含量97.0%;“活热沐浴剂”（福建金谷科技开发有限公司）;甲醇（色谱纯）;乙醇、盐酸（分析纯）;市购红辣椒;二次蒸馏水。

 

　　2 方法与结果

     

　　2.1 测定方法的建立

    

　　2.1.1 色谱条件 Symmetry（反向）十八烷基键合硅胶柱3.5μm，4.6mm×75mm。检测波长280nm。流动相:甲醇:水:磷酸=60:40:0.2。经试验辣椒碱在反向柱上的保留时间与流动相极性呈负相关，即极性越大保留时间越短。但保留时间太短则样品溶液中辣椒碱与杂质色谱峰不能完全分离（图1B）。所以只有通过试验调节恰当的流动相极性，才能使辣椒碱与杂质恰好完全分离（图1C）。进样量5μl。

 

　　图1 对照品、样品高效液相色谱图（略） A—对照品  B—样品1  C—样品2

     

　　2.1.2 样品溶液的制备 精密称取“2.2.2”或“2.2.3”项下的辣椒提取液0.2g于离心试管中，精密加入4ml甲醇，超声振荡萃取，离心分离，取滤液为样品溶液，备用。测定时经0.44μm滤膜过滤即可进样操作。

    

　　实验发现辣椒提取液中辣椒碱的萃取量与超声振荡的时间有较大关系，超声振荡时间5～8min较佳，实验过程均取5min。

    

　　2.1.3 方法学考察

    

　　2.1.3.1 标准溶液的制备 称取11.20mg辣椒碱标准品，以甲醇溶解并定容至100ml，配成112μg/ml的标准溶液。

 

　　2.1.3.2 线性关系 取标准溶液进样，进样体积分别为1、2、4、6、8、10μl，在上述色谱条件下测定峰面积，得辣椒碱标准曲线直线方程为:Y=3341.3X，r=0.9993。（Y为色谱峰面积nm 2 ，X为辣椒碱含量μg），线性范围为（11.2～112）μg/ml。

    

　　2.1.3.3 进样精密度 精密量取“2.1.3.1”标准液5μl进样，平行5次，记录色谱峰面积。结果分别为370736，371055，370255，369942，371032，平均值370592，RSD%为0.14。可见，本色谱条件下有较高的进样精密度。

    

　　2.1.4 稳定性试验 精密吸取“2.1.2”项下的样品溶液5μl，2.5h进样1次。共测定6次，峰面积分别为1815046、1815089、1809847、1812005、1810536、1811889，平均峰面积为1806069，RSD为0.12%，表明样品在15h内稳定。

 

　　2.1.5 样品测定 取不同批次的“活热沐浴剂”产品，按“2.1.2”项下的方法制备样品溶液，并按上述色谱条件测定，产品中辣椒碱含量（mg/g）分别2.17，2.87，2.11，2.77，2.98。

    

　　2.1.6 重现性 从同一份“活热沐浴剂”样品中，按“2.1.5”项下的同一处理方式平行5份，辣椒碱含量（mg/g）检测结果分别为2.01，2.00，2.00，2.00，2.02。平均值为2.00，RSD%为0.4，重现性良好。

    

　　2.1.7 回收率 取“2.1.6”项下所用同一批“活热沐浴剂”样品，精密称取0.2g，置于离心试管中，分别精密加入1ml辣椒碱标准液（2.1.3.1），再精密加入1ml甲醇，超声振荡，离心分离，经0.44μm滤膜过滤，进样操作，结果如表1。

     

　　表1 回收率试验（略）

    

　　2.2 提取工艺

    

　　2.2.1 原料处理 将市购红辣椒晒干，粉碎过20目筛后保存于干燥器中。

    

　　2.2.2 乙醇提取法 选择乙醇浓度，提取液用量，提取时间，提取温度4个因素，每个因素选3个水平，设计提取工艺，详见表2。

     

　　表2 乙醇溶液提取工艺因素水平表（略）

     

　　将提取液按“2.1.4”项下所述的HPLC法测定辣椒碱含量。以辣椒碱提取率为提取效果的评价指标。结果详见表3、表4。由方差分析可知，辣椒碱提取率影响因素主次顺序为:乙醇用量>乙醇浓度>提取温度>提取时间。考虑到使总体成本最低，乙醇溶液提取辣椒碱的最佳条件为:60%乙醇溶液，3倍量，浸泡12h，在70℃下提取3次，每次1h。

     

　　表3 乙醇溶液提取工艺正交试验设计表及结果（略）

 

　　表4 乙醇溶液提取法结果方差分析表（略）

    

　　2.2.3 酸性水溶液提取法 选择酸性提取液的盐酸浓度，提取液用量，提取时间，提取温度4个因素，每个因素选3个水平，设计提取工艺，详见表5。

     

　　表5 酸性溶液提取工艺因素水平表（略）

    

　　由方差分析可知，辣椒碱提取率影响因素主次顺序为:酸度>时间>温度>倍数.考虑到使总体成本最低，盐酸水溶液提取辣椒碱的较佳条件为:1%盐酸溶液，1倍量，浸泡12h，在80℃下提取3次，每次3h。

    

　　将提取液按“2.1.4”项下所述的HPLC法测定辣椒碱含量。以辣椒碱提取率为评价提取效果的指标。结果详见表6、表7。

     

　　表6 盐性溶液提取法正交实验设计表及结果（略）

　　

　　表7 盐性溶液提取法结果方差分析表（略）

     

　　3 讨论

     

　　高效液相色谱法测定辣椒提取液中辣椒碱含量，方法的准确度、精密度、重现性、回收率都较高，它将对生产上最佳提取工艺的确定和生产质量的控制有着重要指导意义。

    

　　辣椒中辣椒碱含量因辣椒的品种、产地、栽培条件和生长周期等因素的不同而差异很大，其次还受到提取工艺的影响。从提取工艺的筛选结果看，采用乙醇溶液提取辣椒碱的效果略优于采用盐酸水溶液提取。但二者的提取机制略有不同，乙醇在提取中是起着溶剂的作用，而盐酸溶剂是作为质子酸与辣椒碱作用，从正交试验结果看，提取率随着酸度的提高而提高，可能酸度提高，提取率还将提高，有待于进一步通过试验验证。此外，酸性水溶液提取还有如下优点:①提取液成本低，且不必回收，能耗和物耗少，综合成本低;②工艺较简单，设备投入少，无挥发废气产生，对车间安全生产要求不高，为工业化生产创造有利条件。所以，采用酸水提取工艺目前虽尚不成熟，还有待完善，但从长远考虑，将有广阔的应用前景。