一般食品蛋白质含氮量为l0％如肉、蛋、豌豆、玉米等，其换算系数为6.25，小麦取5.70，大米5.95、乳制品6.38、大豆5.17，动物胶5.55。

 

 

 

一、目的与要求：

 

掌握微量凯氏法测定蛋白质总氮量的原理及操作技术。包括样品的消化，蒸馏吸收及滴定与含氮量的计算。

 

 

 

 二、原理：

 

凯氏定氮法：食品经加硫酸消化使蛋白质分解，其中氮素与硫酸化合成硫酸铵。然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸液吸收后，再用盐酸或硫酸滴定根据盐酸消耗量，再乘以一定的数值即为蛋白含量，其化学反应式如下。

 

 

 

(1)2NH2(CH2)2COOH+13H2S04   

 

(NH4)2S04+6C02+12S02+  16H2

 

(2)(NH4)2SO4+2NAOH-----2NH2+2H2O+NA2SO4

 

(3)2NH3+4H3BO3----(NH4)2B4O7+5H2O

 

(4)(NH4)2B407+H2S04+5H20-(NH4)9SO4+4H2BO2

 

 

 

三、试剂与仪器：

 

1.硫酸钾

 

2.硫酸铜   

 

3.硫酸

 

4.2％硼酸溶液

 

5.40％氢氧化钠溶液

 

6.混合指示剂：把溶解于95％乙醇的0.l％溴甲酚绿溶液10毫升和溶于95％乙醇的0.l％甲基红溶液2毫升混合而成

 

7.0.01NHCL标准溶液或0.01N硫酸标准溶液

 

8.凯氏微量定氮仪一套

 

9.定氮瓶100ml或50ml一只

 

10.三角瓶150ml 3只

 

11.量筒50ml、10ml、100ml

 

12.吸量管10ml只

 

13.酸式滴定管1支

 

14.容量瓶100毫升1只

 

15.漏斗1只

 

 

 

四、操作方法

 

1.样品处理：精密称取0.2-2.0g固体样品或2-5g半固体样品或吸取10-20ml液体样品（约相当氮30-40mg），移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，3g硫酸钾及20ml硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45度角斜支于有小孔的石棉网上，小火加热，待内容物全部碳化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5小时。取下放冷，小心加20ml水，放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。

 

取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸铵同一方法做试剂空白试验。

 

 

 

2.按图装好定氮装置，于水蒸气发生器内装水约2/3处加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。

 

 

 

3.向接收瓶内加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示剂1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml样品消化液由小玻璃杯流入反应室，并以10ml水洗涤小烧杯使流入反应室内，塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞。将10ml 40%氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其缓慢流入反应室，立即将玻璃盖塞紧，并加水于小玻璃杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏，蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏5min。移动接收瓶，使冷凝管下端离开液皿，再蒸馏1min，然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.01N硫酸或0.01N盐酸标准溶液定至灰色或蓝紫色为终点。同时吸取10.0ml试剂空白消化液按3操作。

 

 

 

计算：

 

X =【（V1-V2）*N*0.014)/( m*（10/100）)】+F*100　

 

X：样品中蛋白质的含量，g；

 

V1：样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml；

 

V2：试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，ml；

 

N：硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度；

 

0.014：1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数；

 

m：样品的质量（体积），g（ml）；

 

F：氮换算为蛋白质的系数。

 

注：

 

1）样品应是均匀的，固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。

 

2）样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上，万一沾附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低。

 

3）消化时如不容易呈透明溶液，可将定氮瓶放冷后，慢慢加入30%过氧化氢2-3ml，促使氧化。

 

4）在整个消化过程中，不要用强火，保持和缓的沸腾，使火力集中在凯氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下。使氮有损失。

 

5）如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这样会形成硫酸氢钾，而不与氨作用，因此当硫酸过多的被消耗或样品中脂肪含量过高时，要增加硫酸的量。

 

6）加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点，硫酸铜为催化剂，硫酸铜在蒸馏时作碱性反应的指示剂。

 

7）混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液。

 

8）氨是否完全蒸馏出来，可用pH试纸试馏出液是否为碱性。

 

9）吸收叶也可以用0.01当量的酸代表硼酸，过剩的酸液用0.01N碱液滴定，计算时，A为试剂空白消耗碱液数，B为样品消耗碱液数，N为碱液浓度，其余均相同。

 

10 ）以硼酸为氨的吸收液，可省去标定碱液的操作，且硼酸的体积要求并不严格，亦可免去用移液管，操作比较简便。

 

11）向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀物，这是由于分解促进碱与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀。有时铜离子与氨作用，生成深兰色的结合物[Cu(NH3)4]+