由于影响因素过多，细胞/组织培养中出现的一些问题往往很难分析并得到解决，因此被人戏称为“黑色艺术”或“巫术”。本文列举了一些动物细胞/组织培养中常见的问题及解决方法。

       1.培养试剂的保存：

       血清：-5oC --20oC 保存，避免反复冻融。

       培养基: 2oC – 8oC避光保存。

       完全培养基: 2oC – 8oC避光保存，并在2周内用完。

       尽量缩短血清和培养基见光的时间

       2.液体培养基中谷氨酰胺使用方法：

       很多细胞生长要求在培养液中添加谷氨酰胺。谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于-20◦C冰冻保存，用前加入培养基中。加有谷氨酰胺的液体培养基4◦C 冰箱储存两周以上时，应重新加入原来量的谷氨酰胺。另一种选择是使用L-谷氨酰胺的衍生物 -L-alanyl-L-glutamine dipeptide（如启维益成公司代理的GenDepot的产品Glutaplex配方中含有的成分之一） 替代L-谷氨酰胺。Glutaplex与L-谷氨酰胺相比更加稳定，降解比较慢，提高细胞的存活和生长，极大降低对细胞有毒性的氨的积累。

       3.培养基中是否应加酚红：

       酚红在培养基中被用来作为pH值的指示剂，中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，特别是雌激素。为避免固醇类反应，培养细胞尤其是哺乳类细胞时，应使用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时不使用加酚红的培养基。

       4.使用血清应注意的问题：

       1）血清第一次使用前，是否应在56oC，30分钟加热血清以灭活补体系统？

       激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。实验显示，经过正确处理的热灭活血清对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞生长只有微小的促进或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率降低。而经过热处理的血清沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染。而把血清放在37℃环境中又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。若非必须，可以不需要做热处理这一步。不但节省时间，更确保血清的质量。

       2）通常使用的血清的种类：

       新生牛血清：新出生牛5天内取血制成。小牛血清：小牛出生16周以内采血制成。胎牛血清：（进口血清）要求剖腹取胎制成。国内厂家往往不能做到，经常把出生2天以内采血称为胎牛血清。根据血清的生产工艺及血红蛋白、内毒素含量又分为：（1）特级胎牛血清：40纳米过滤，内毒素含量≤10EU， 血红蛋白含量≤10mg/dl。（2）优等胎牛血清：经过3次100纳米过滤，内毒素含量≤25EU/ml，血红蛋白含量≤25mg/ml。（3）标准胎牛血清：3次100纳米过滤，低内毒素，低血红蛋白含量。

       3）为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀?

       有些胎牛血清产品没有预老化，储存在2-8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白，如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。建议在-20℃储存胎牛血清，避免反复冻融。

       4）血清解冻后发现有絮状沉淀物出现：

       血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成。而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解冻后也会存在于血清中，也是造成沉淀物的原因之一。但这些絮状沉淀物并不影响血清本身的质量。若欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心，上清液即可接着加入培养基内一起过滤。最好不使用过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞过滤膜。

       5）如何避免沉淀物的产生?

       我们建议您在使用血清的时候，注意下列的操作: (1)解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-2℃至4℃过夜，37oC水浴解冻)。若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃)，非常容易产生沉淀物。(2)解冻血清时要随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。(3)请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。(4)如果在高于40oC的水浴中融化并且不时常摇晃混匀，非常容易造成沉淀物增多。同样血清的热灭活也造成沉淀增多，若非必要，可以省去热灭活。(5)若必须做血清的热灭活，请遵守56℃，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。

       5.培养用液pH对细胞生长的影响：

       由于，大多数细胞培养适宜的pH为7.2-7.4，偏离此范围对细胞将产生有害的影响。各种细胞对pH的要求也不完全相同，原代培养细胞一般对pH变动耐受力差，无限细胞系耐受力强。但总体来说，细胞耐酸性比耐碱性强一些，偏酸环境中更利于细胞生长。因此，我们在配制培养用液时，可把液体的pH稍微调得偏酸一些。液体在经过0.10um或0.22um滤膜过滤时，溶液的pH还会向上浮动0.2左右。

        6.培养基pH变化迅速：

        培养箱中CO2浓度不正确。碳酸氢钠在培养液中浓度范围为2.0 – 3.7g/L时，CO2的浓度范围应分别为5% -10%。

       7.使用培养基时应注意的问题：

       培养基在使用前需37oC预热。 细胞培养过程中，吸取过培养液的吸管不能再用火焰烧灼，防止残留在吸管内的培养基焦化，将有害物质带入培养液中。尽量缩短各种液体、细胞的暴露时间，减少污染机会。避免液体间、细胞间的交叉污染。配制完全培养基时，配制的量最好在2周内用完为好。

       8.细胞传代消化时胰蛋白酶的使用问题：

       培养细胞胰蛋白酶溶液的消化能力和溶液的pH、温度、胰酶浓度及溶液中是否含有Ca++, Mg+离子和血清等因素有关。通常情况下，pH 8.0 , 温度 37 oC 其作用能力最强。另外，钙、镁离子及血清均能大大降低其消化能力。每次进行传代消化前，一定要用无钙镁离子的PBS液或D-Hanks液反复冲洗细胞培养瓶，以便将含血清的培养基冲洗干净，这样可大大提高消化液的消化能力。通常使用的消化液浓度为： （1）０.０５％胰蛋白酶-ＥＤＴＡ； （2）０.２５％胰蛋白酶-ＥＤＴＡ。多数细胞传代消化可使用０.０５％胰蛋白酶-ＥＤＴＡ这种消化液。

       第一次开瓶后应立即少量分装于无菌管中，保存于–20℃，避免反复冻融造成胰蛋白酶活性降低，并可减少污染的机会。

       注意：如果选用无血清培养基（如启维益成公司代理的TNC Bio公司生产的产品 -完全无动物成分的血清替代品XerumFreeTM与其他培养基混合配制的无血清培养基），在细胞传代时，不可使用胰蛋白酶消化，因为胰蛋白酶在无血清时可去除细胞膜表面的受体，这种情况应使用AccutaseTM消化。

       9.贴壁细胞在用蛋白酶消化时不易分离：

       1）培养液中存在酶的抑制剂，可使用无钙镁离子的37oC预热的Dulbecco’s PBS或胰酶-EDTA洗一遍，再消化

        2）胰酶浓度太低，使用更高浓度的胰酶，更高浓度的EDTA或不同的酶消化，37oC消化以提高酶活性

       3）细胞处于铺满状态时间太长，形成细胞间的紧密连接，以后注意在细胞铺满之前进行继代培养。

       10.细胞分离后形成团块：

       1) 细胞分散过程太过分，如用力吹吸、酶浓度过高、消化时间过长或温度过高，酶溶液有毒性（如缓冲液pH或渗透压不正确等）以至基因组DNA从破裂的细胞中释放出来。解决方法是在细胞悬液中加入1滴无菌的1mg/ml溶于水中的DNA酶。

       2)去除上清时，细胞离心的强度太大或时间太长，应使用125g, 10分钟轻微离心。

       11.悬浮细胞形成团块：

       1）培养液中含有钙镁离子

       2）支原体污染

       3）由于过度消化造成细胞裂解，释放出基因组DNA

       12.细胞不贴壁：

        1）消化时间过长，细胞膜上的贴壁蛋白被去除了

        2）培养基中的血清或贴壁因子（常见于无血清培养基）不足，可在培养基中加入贴壁因子或使用胶原蛋白、多聚L赖氨酸、纤连蛋白等包被的培养瓶。

       3）支原体污染