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产品编号：BTN51102
规格：100T/250T
产品及特点：
本产品是在动物RNA提取试剂盒基础上根据细菌提取的具体情况改良而得。它基于异硫氰酸胍/酚/氯fang提取RNA原理，可用于包括E.coli、Campylobacter fetus、Pseudomo
1. 操作简单快速，只要十分钟左右,可以全在室温下进行。
2. 所得 RNA 质量高,OD260/OD280 一般在 1.9，不含基因 DNA 污染。
3. 灵敏度高，可以从一个菌落中提取到普通电泳能够检测到的总 RNA。
4. 性价比高于进口同类产品。
规格及成分：
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成分 |
100T |
250T |
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细菌RNA提取试剂 |
100ml |
250ml |
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说明书 |
1份 |
1份 |
保存条件：
常温运输，4℃保存，有效期一年。
自备试剂：
氯fang，异丙醇，75%乙醇，RNA 溶解液。
使用方法：
1. 在 1.5 mL 塑料离心管中离心收集 0.2-1.5 mL 新鲜细菌(注意:由于细菌RNA 半衰期十分短，所以，必须使用zui新鲜细菌)，吸尽液体培养基，加入1 mL细菌 RNA提取试剂盒并用枪充分吹打，确保细菌全部裂解，没有块状物。
如果使用菌落，则用接种环小心将其转移到装有1mL 细菌 RNAOUT 的1.5 m 塑料离心管中，用移液枪吹打均匀。在细菌数较少时，建议使 用助沉剂 RNADOWN 以提高 RNA 回收率。
2. 加入 0.2 mL 氯fang，在振荡器上充分振荡混均 30 秒（必须将管底的液体振荡起来，否则不能有效将 DNA 打断和去除蛋白质）。
3. 12000-15000g室温离心3分钟。上清液无色，下层液呈篮色，中间为蛋白质。小心将上清液转移到另一干净 1.5ml塑料离心管中，上清液体积约为0.6mL。为避免触及中间层的 DNA 和蛋白质，建议分小量多次 吸取，并且只取 0.5 mL，留 0.1 mL 左右。当细菌数量较少时，中间层十分松散，上清时很容易吸到下层有机相，需要更加小心。
4. 在上清液中加入等体积的异丙醇，振荡器上振荡混均 30秒。
5. 12000-15000 室温离心 3-10 分钟，RNA 将在管底侧面形成沉淀。
6. 小心吸弃上清液，注意不要吸弃 RNA 沉淀。
7. 在离心管中加入 1mL 75%乙醇，振荡器上振荡混均 30 秒。
8. 12000-15000 g 室温离心 1 分钟。
9. 小心吸弃上清液，注意不要吸弃 RNA 沉淀。
10. 重复第 8 到第 10 步一次。
11. 短暂快速离心，用移液枪小心吸弃残留液（约 50 μL）。
12. 短暂放 1-2 分钟后加入适量 RNA 溶解液使 RNA 沉淀溶解，可以立即使用或存放于-80℃长期保存。
13. RNA 完整性的电泳检测：
如果需要做 Northern 杂交，强烈建议用户使用甲醛变性胶进行RNA电泳，因为非变性胶不能分离所有的RNA 分子（BioTechniques，28：414，2000）。如果是简单检测，可以使用TAE或百奥莱博的SuperBuffer-2 DNA/RNA 两用快速电泳液，但文献报道必须使用变性上样液（BioTechniques，9：558，1990）。普通 DNA 上样液不含变性剂，也没经过去 RNase 处理，所以zui好不要使用。 尤其需要注意的是不要使用TBE 进行RNA 电泳，因为TBE 所含硼酸是研究多糖的经典方法----硼酸络合法中的关键成分，硼酸通过与RNA 核糖中的羟基发生络合反应，形成RNA 分子内或RNA 分子间的络合复合物，使同样长度的RNA 具有不同的泳动速度，电泳条带弥散，同时有大的RNA 络合复合物迟留在加样孔中（一般会误以为是基因组DNA 污染）。RNA 分子内或RNA 分子间的络合物的形成的多少和比例又与硼酸与RNA的数量比例有关，而RNA 样品中污染的其他多糖（如植物中提取的RNA）也会参与此反应，使硼酸对RNA 电泳的影响更复杂，所以TBE 对RNA 电泳的影响没有规律性和重复性。有的样品可以使用有的又不行，zui好是避免使用。
由于细菌细胞中70-80%的RNA为rRNA，后者又由23S (约 3700nt)，16S (约1700 nt)和5S (约100 nt)三种组成，所以变性胶电泳后应该在UV下看见三条清晰的rRNA带。由于核酸长度与结合 EB 的数量成正比（当然还与RNA 的二级结构有关，双链部分结合能力比单链部分强），所以23S rRNA条带的荧光强度一般比16S rRNA条带的荧光强度强2倍。如果这两条rRNA 带不清晰或比例小于此范围则表示 RNA 有降解（因为大的 RNA 被酶降解的可能更大）。
14. RNA 产量产率测定：
将 5-10 μL RNA 溶于 TE 缓冲液中(pH7.5-8.2 之间)检测其在OD260 的光吸收。通过光吸收可以得出 RNA 浓度（1 OD260 的RNA=40 μg/mL），进而计算出 RNA 的产量和产率。注意不要将 RNA 稀释在 DEPC 水中检测 OD260 和 OD280，否则光吸收比在 TE 中测得的低 10%-15%，因为核酸光吸收跟溶液 pH 相关，而 DEPC 水中的DEPC 高压分解后产生的 CO2 与水反应生成碳酸，使溶液 pH 降低进而降低 RNA 的光吸收。
15. RNA 纯度测定：
无污染的总 RNA 的 OD260/OD280一般在 1.8-2.1 之间(具体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关)， OD260/OD230 一般在2.0-2.3 之间，如果低于或高于此范围则分别表示样品可能有蛋白质或多糖的污染，但一般不影响 RT-PCR 等反应。蛋白质污染可以通过酚/氯fang抽提一次然后酒精沉淀去除，DNA 和多糖污染可以分别用百奥莱博的DNAErasol和 PS Erasol去除。
疑难解答：
Q：上样孔里的红色荧光物一定是污染的基因组DNA吗？
A：不是。用 TAE 或 TBE 电泳液和非变性胶电泳 RNA 时容易产生此现象，百奥莱博初步研究发现大部分红色荧光物是变性不充分的单链RNA 通过碱基互补或通过硼酸络合（如果使用TBE作电泳液的话）形成的复合物，加 RNase处理后，这些红色荧光物一般会消失。为避免此现象，建议zui好使用甲醛变性胶电泳。如果需要使用非变性胶，也必须在上样前使RNA变性。使用我司基因优化的上样/变性/染色三用溶液 RNAON 可以使 RNA 在非变性胶上电泳时也有较好分辨率。使用非变性胶时，可以使用TAE或超快电泳液SuperBuffer-2，zui好不要使用TBE缓冲液，因为TBE中的硼酸能与RNA的多羟基形成复合物，RNA 很难形成锐利的条带。
Q：如何确认和去处除污染的基因组 DNA？
A：如果怀疑有 DNA 污染，可以用 RNase 处理 RNA 样品，然后再电泳。如果上样孔里的红色荧光物不消失，则表示是基因组 DNA 污染。进一步确认可以使用 PCR 扩增法。去除污染的 DNA 可以使用非酶的 DNA 去除剂DNA Erasol 或 RNase-free DNase，由于 RNase-free DNase 一般都有残留的RNase 污染，所以必须严格按照厂家提供的使用说明书进行操作。