产品编号：BTN51104

规格：2μg

产品及特点：

本产品是在百奥莱博克必隆G 载体的基础上开发的专门用于高效快速克隆平末端DNA 片段的专用载体,它是由Sma I 酶切克必隆G 载体后经过纯化得到的即用型线性载体。跟克必隆G 载体一样，本产品带有自杀基因，Sma I 位点位于该基因之中，只有当外源平末端DNA 插入片段插入Sma I 位点,连接后的DNA 转化的细胞才能生长,所以zui后得到的转化子几乎都是含有平末端DNA 插入片段的重组子。

1. 即用性，可以直接用于连接反应，免去繁琐的酶切，电泳检测，纯化，去磷酸化，再纯化等步骤。

2. 具有克必隆-G 载体的所有优点，包括零背景,适用于所有E.Coli 菌株,多拷贝的colEI 型复制起始位点。

3. 高效率，由于自杀基因的使用有效地减除了载体自身环化对平末端DNA 克隆的影响，自身环化得到的转化子在有选择液存在时只占总转化子的1%-5%。

4. 应用广泛，可用于克隆酶切产生的平末端DNA，Pfu 酶扩增的PCR片段，cDNA 片段，3'和5'RACE 片段, Taq 酶扩增的PCR 片段(部分为平末端）。

格及成分：

保存条件：

低温运输, -20°C保存，有效期两年。

自备试剂：

1. 外源DNA 片段。如果含又DNA 片段的反应液中不含其他载体DNA（如酶切反应液，PCR 反应液)，可以不需要凝胶回收,灭活酶后即可直接将反应液用于连接反应。PCR 引物5’端一般为OH 基团，zui好在PCR 后用T4 激酶磷酸化，否则连接效率极低。

2. 感受态宿主菌。DH5α，DH10B 或HB101 等常用E.coli 菌株。

3. 连接反应试剂。请购买现成试剂盒。

4. 选择培养基。在倒LB 平板之前随产品赠送的选择液和Amp (如果附赠的选择液含Amp,则不必须额外加Amp)按比例加入到LB 之中,使选择液终浓度为1×，Amp 终浓度为50 μg/mL(如果附赠的选择液含Amp,稀释到1X 后Amp 的终浓度即为50 μg/mL),混匀后倒盘。

使用方法：

1. 连接反应

a. 取新的经过灭菌处理的0.5 ml Eppendorf 管,编号。

b. 将100 ng 载体DNA 转移到无菌离心管中，加两倍摩尔量的外源DNA 片段，折合成重量(ng) = (外源DNA 片段bp 数X 100 ng×2)/5330 bp (载体DNA 长度)

c. 加蒸馏水至体积为8 μl，于45℃保温5 分钟，使重新退火的粘端解链。将混和物冷却至0℃。平末端DNA 片段的克隆可以省去45℃保温5 分钟这一步。

d. 加入10×T4 DNA ligase buffer 1μl, T4 DNA ligase 0.5 μl，混匀后用微量离心机将液体全部甩到管底，于16℃保温1-24 小时。

e. 同时做只有外源DNA 片段没有质粒载体的组对照反应。没有必要做只有质粒载体而无外源DNA 的对照组，因为自身环化的载体不能生长, 能够生长的转化子基本上是两个载体分子相互连接形成的新载体。但在有两倍于外源DNA 片段存在的情况下,两个载体分子连接的机率很小。

2. E.coli感受态细胞的转化

a. 各取每组连接反应液2μl按标准方法转化E. coli 感受态细胞。

b. 每组连接反应转化原液取100μl用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上，37℃下培养半小时以上,直至液体被完全吸收。