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产品编号：BTN60905
规格：10000U/50000U
产品及特点：
该酶是突变型的MMLV 逆转录DNA 聚合酶，从表达Molo
1. 延伸性能好，可合成长达12.5 Kb 的fμLl-length cDNA。
2. zui佳反应温度为42℃，但在50℃时仍然有活性，70℃10 分钟能使其失活。
3. 能以Cy3-，Cy5-，rhodamine-， aminoallyl-，fluorescein 等标记的nucleotides 为底物。
4. 可用于first strand cDNA 合成，second strand cDNA 合成，DNA labeling，RNA primer extension 等。
5. 与PCR 兼容，RT 产物可以用于PCR 和real-time PCR。
6. 能被金属螯合剂，无机磷酸，焦磷酸和多胺抑制。
7. 没有RNase H 活性。
规格及成分：
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成分 |
10000U |
50000U |
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MMLV 逆转录酶 (200 U/μL) |
50μl |
50μl×5 |
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5×RT Buffer |
1ml |
1ml×5 |
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说明书 |
1份 |
1份 |
保存条件：
低温运输，-20℃保存，有限期一年。
使用方法：
一：合成PCR 用的1st-strand cDNA
1. 按下表配制RT 反应体系:
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RNA |
模板 |
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总RNA |
100-500 ng |
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或poly(A) mRNA |
10-500 ng |
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或专一的RNA |
0.01pg-500ng |
注意：RNA 样品不能有基因组DNA污染。
引物
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Oligo (dT)18(0.5ug/μL) |
1 μL |
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或随机引物(0.2ug/μL) |
1 μL |
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或RNA 模板专一性引物 |
15-20pmol |
注意：随机引物于RNA 模板的比例跟zui后得到的cDNA 的平均长度成反比。
RNase-free 水 补水到12 μL
2. 70℃保温5 分钟后立即冰浴。
3. 严格按下表顺序加入各成分：
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5×RT Buffer |
4 μL |
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RNase Inhibitor (20U/μL) |
1 μL |
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dNTP (10 mM each) |
2 μL |
4. 37℃保温5 分钟。对富含二级结构的高GC RNA 模板，可以改成45℃保温5 分钟。如果使用随机引物，则保温温度只能是25℃（5 分钟）。
5. 加入1 μL (=200 U) MMLV 逆转录酶，反应终体积为20μL。
6. 42℃保温60 分钟（但如果使用随机引物，需要先25℃保温10 分钟，然后再转移到42℃保温60 分钟）。
7. 70℃保温10 分钟以终止反应，放置在冰上待用。合成的cDNA 可以直接作为PCR 模板使用，不需要纯化。
二：合成建文库用的1st-strand cDNA
1. 按下表配制RT 反应体系:
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RNA |
模板 |
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或poly(A) mRNA |
1 ug |
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或专一的RNA |
0.5-1ug |
注意：RNA 样品不能有基因组DNA污染。
引物
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Oligo (dT)18(0.5ug/μL) |
1 μL |
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或随机引物(0.2ug/μL) |
1 μL |
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或RNA 模板专一性引物 |
100pmol |
注意：随机引物于RNA模板的比例跟zui后得到的cDNA 的平均长度成反比。
RNase-free 水 补水到12 μL
2. 70℃保温5 分钟后立即冰浴。
3. 严格按下表顺序加入各成分：
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5×RT Buffer |
4 μL |
|
RNase Inhibitor (20U/μL) |
1 μL |
|
dNTP (10 mM each) |
2 μL |
4. 37℃保温5 分钟。对富含二级结构的高GC RNA 模板，可以改成45℃保温5 分钟。如果使用随机引物，则保温温度只能是25℃（5 分钟）。
5. 加入1 μL (=200 U) MMLV 逆转录酶，反应终体积为20μL。
6. 42℃保温60 分钟（但如果使用随机引物，需要先25℃保温10 分钟，然后再转移到42℃保温60 分钟）。
7. 70℃保温10 分钟以终止反应，放置在冰上待用。合成的cDNA 可以用于第二链cDNA 的合成或放置在-20℃。