产品编号：BTN60906

规格：10T/50T

产品及特点：

本试剂盒提供合成cDNA 一链所需要的全部试剂。其原理是用突变的莫洛尼氏鼠白血病病毒反转录酶(M-MμLV RT)高效合成mRNA 的全长cDNA 拷贝。

1. 使用突变的反转录酶，内源RNase H 活性低。

2. zui长可合成13 Kb 的cDNA。

3.可以使用oligo-dT、随机引物和RNA 专一性引物三种引物(前两种本试剂盒提供)。

4.总RNA、poly(A)+RNA 或特殊RNA 均可作为模板。

5.可用于cDNA 文库构建、RT-PCR、探针标记等。

规格及成分：

保存条件：

低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一：合成PCR 用的1st-strand cDNA

1. 按下表配制RT 反应体系:

引物

2. 70℃保温5分钟后立即冰浴。

3. 再加入5 μL RT Buffer(含dNTP)。

4. 37℃保温5分钟。对富含二级结构的高GC RNA模板，可以改成45℃保温5分钟。如果使用随机引物，则改成25℃ 5分钟。

5. 加入2 μL MMLV 逆转录酶(含RI)，反应终体积为20 μL。

6. 42℃保温60分钟(但如果使用随机引物，需要先25℃保温10分钟，然后再转移到42℃保温60分钟)。此步为RT 反应。

7. 70℃保温10分钟以终止反应，然后放置在冰上待用。合成的cDNA可以直接作为PCR模板使用，不需要纯化。

二：合成建文库用的1st-strand cDNA

1. 按下表配制RT 反应体系:

2. 70℃保温5分钟后立即冰浴。

3. 再加入5 μL RT Buffer(含dNTP)。

4. 37℃保温5分钟。对富含二级结构的高GC RNA模板，可以改成45℃保温5分钟。如果使用随机引物，则改成25℃ 5分钟)。

5. 加入2 μL MMLV 逆转录酶(含RI)，反应终体积为20μL。

6. 42℃保温60分钟(但如果使用随机引物，需要先25℃保温10分钟，然后再转移到42℃保温60分钟)。此步为RT 反应。

7. 70℃保温10分钟以终止反应，放置在冰上待用。合成的cDNA可以用于第二链cDNA 的合成或放置在-20℃长期保存。

三：用对照模板合成cDNA

1. 按下表配制RT 反应体系:

2. 70℃保温5分钟后立即冰浴。

3. 再加入5 μL RT Buffer(含标记dNTP，本试剂不提供)。

4. 37℃保温5分钟。如果使用随机引物，则保温温度只能是25℃。

5. 加入2 μL MMLV 逆转录酶(含RI)，反应终体积为20μL。

6. 42℃保温60分钟(但如果使用随机引物，需要先25℃保温10分钟，然后再转移到42℃保温60分钟)。

7. 加1μL 0.5M EDTA，放置在冰上待用。

8. 电泳检测。合成的cDNA 的量一般有加入RNA 总量的50%以上，电泳一般能出现1.1Kb 的片段(如果使用随机引物，将出现多个小片段)。