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产品编号:BTN70702
规格:50T
产品及特点:
分枝杆菌属(Mycobacterium)是极为古老的细菌,与人类的疾病相关的就有25种以上,包括引起结核病的结核分枝杆菌(Mycobacteria tubercμLosis)。近年来由于多重耐药性分枝杆菌的出现,分枝杆菌再次成为人们关心的细菌。PCR快速诊断是目前检测分枝杆菌的主流方法,但由于此类细菌具有十分独特的坚硬的细胞壁,快速提取其基因组DNA一直是十分棘手的技术问题。本产品就是为解决这一问题而开发,具有下列特点:
1. 每克分枝杆菌湿重可以提取到3-4mg基因组DNA。
2. 操作简单,整个过程约60分钟左右,容易放量操作。
3. 适用于培养的分枝杆菌,也适用于含分枝杆菌的痰液等样品。
4. 价廉物美,与国外同类产品相比质量相当,但价格便宜。
规格及成分:
成分 |
规格 |
TE缓冲液 |
50ml |
溶液A |
7.5ml |
溶液B |
15 mL(棕色塑料瓶) |
说明书 |
1份 |
保存条件:
常温运输及保存、有效期一年。
自备试剂:
氯fang、70%乙醇、无水乙醇。
使用方法:
注意:文献报道部分分枝杆菌在DNA提取过程中还有形成菌落的能力,所以任何丢弃的溶液都必须按有传染性的污染物品对待,并严格按有关部门要求进行消毒处理。
一: 如果细菌来于痰液样品,则按下面方法进行预处理(本试剂盒不提供所需试剂,操作步骤仅供参考)
1. 用痰液收集器收集约5mL患者深咳痰并转移到15mL塑料离心管中。
2. 加入等量的化痰液(2% NaOH、1.45%柠檬酸钠、0.5% N-乙酰-L-半胱氨酸),震荡使二者充分混匀。37℃放置25-40分钟。此步处理可以使粘稠的痰液便于操作,同时可以裂解不属于分枝杆菌的杂菌,只有分枝杆菌保持完整。
3. 5000 g离心5分钟,弃上清液。分枝杆菌将沉淀在管底,可以直接用于DNA提取。也可以保存在-20℃待用。
二: 如果分枝杆菌来于培养的菌落,则按下面方法进行预处理
1. 刮取培养的菌苔到1 mL TE缓冲液中(装在1.5mL塑料离心管中)并充分震荡使细菌均匀重悬。如果是培养的液体菌液或其他液体样品材料,则取1mL菌液到1.5 mL塑料离心管中。一次提取所需zui佳细菌用量为109 CFU左右。
2. 80℃加热20分钟杀灭分枝杆菌使之失去传染性。
4. 常温5000 g离心5分钟,弃上清液。分枝杆菌将沉淀在管底,可以直接用于DNA提取。也可以保存在-20℃待用。
三: 分枝杆菌基因组DNA提取
1. 将150μL 65℃预热过的溶液A加到上步得到的、有分枝杆菌沉淀的塑料离心管中,充分震荡使细菌均匀悬浮。
2. 再加入300μL溶液B(呈乳浊状)和300μL自备氯fang,充分震荡混匀。
3. 将混合液-20℃放置直到液体凝固,一般需要20-60分钟。一定要凝固后才能进入下一步。
4. 将样品管放室温融化后,12000-15000g室温离心5分钟,小心转移上清到一新的离心管中。
5. 在上清液中加两倍体积的无水乙醇,颠倒混匀后12000-15000g室温离心10分钟,小心弃上清。DNA将形成沉淀,不要丢失。
6. 在离心管中加1mL自备70%乙醇,短暂震荡,12000-15000 g室温离心3分钟,弃上清。此步洗涤残留盐离子等杂质。
7. 重复上述操作一次。
8. 短暂离心离心管,小心吸弃残留的液体(约50μL)。此步不要省略,否则残留的液体(含乙醇)将会影响DNA电泳、酶切和PCR等反应。
9. 立即加入50-100μL TE缓冲液充分溶解DNA沉淀。
10. 直接取5-10μL电泳检测DNA,其余放冰箱备用或用于后续反应。