标准菌株虽然在许多药品微生物实验室来说已是不可或缺的实验室必须标准品。然而，手工制备合适浓度的菌悬液依然在不少药品微生物实验室里司空见惯。在预算有限的情况下，规范耐心手工完成所有的操作流程考验着每一个实验室打工人的日常搬砖技能。
手工制备菌悬液的操作步骤
以常用的大肠埃希菌为例（其它菌种方法类似）
1.菌种制备
从菌种保藏管中吸取少量菌液，转接到新鲜的TSB中，于30℃-35℃培养箱中培养18-24小时。
注意事项：也可使用TSA平板进行培养，如果转接的是冷冻保藏管中的菌，zui好再转接一次，使用第二次转接的菌种。
2.稀释
取步骤1的培养物1ml，加入到9ml的pH7.0 氯化钠蛋白质缓冲液中，进行倍比稀释。
注意事项：取菌液的时候，需要先对菌液进行振荡或吹打混匀，方可吸取菌液。可以不用进行倍比稀释，只要能保证最后加入到测试样品中的菌的数量符合要求即可。
3.平板计数
取稀释好的菌液，一般取3个稀释级，每个梯度取2ml，分别加入两块90cm的平皿中，每皿加入1ml菌液，倾注45℃左右的已经经过确定的TSA培养基，轻轻摇匀，静置，培养基凝固后，置30-35℃培养箱中倒置培养48小时。
注意事项：取菌液时同样需要先将试管中的菌液进行混匀。
4.菌落计数
将培养后的平板，置于菌落计数器下进行菌落计数，以确定哪个稀释级的浓度能够满足测试的要求。
注意事项：不建议逐日观察结果，因为平板中可能有凝集水， 逐日观察拿动平板，可能会导致水落到菌落上，菌跟着水流到下一个空白地方，导致结果不准确；另外如果是霉菌，因为有孢子，拿动也会导致孢子落到平板空白地方，影响结果。
操作步骤总结
菌悬液的使用时效性要求导致样品测试需要做至少三个梯度
2020版<中国药典>和<欧洲药典>8.0版要求：“如果放置在室温，菌悬液必须在2小时内使用，如果放置在2-8℃保存，可以在24小时内使用。” 可悬液的菌的数量却需要在48小时后才能确定。所以在不知道菌含量的情况下，样品测试需要做至少三个梯度。
这里说的三个梯度不是说只是计数，而是菌悬液实际运用的测试中也需要三个梯度。
举个例子，某个无菌产品无菌检查中的阳性对照测试，需要做三个对照。当然，同样的产品方法适用性，培养基促生长测试也是如此。
笔者之前在实验室工作，有一次做了5次的菌悬液制备，为了保证实验的成功，每次都做三个梯度。虽然大多数都是同一个稀释级的含量符合要求，但偶尔还会有另一个稀释级才符合要求。还好笔者当时依据的法规中，日常的无菌检查和控制菌检查中还没有阳性对照的要求，不然步骤还会更加繁琐。
手工制备菌悬液步骤流程图
上个流程图，更全面的表达一下整个步骤。
以上流程图中已省略了一些步骤，一句话带过的倍比稀释更是说起来容易做起来难的。
另外，在接收菌种和从冷冻保藏管中取出菌种来使用时，还需进行相应鉴定，所以此流程图已是最简版本。
虽已是简单版本，可在这么多不可控的人工步骤中，连续重复的机械操作必然会增加出错几率的。
定量标准菌株
关于菌悬液的配置是有简单快速的替代方法的。很多制药实验室的小伙伴们对使用定量标准菌株来替代传统手工制备菌悬液的方法已经非常熟悉，该方法可完全替代繁复的倍比稀释配制过程。
有多简单？上个流程图再和上方的手工方法对比一下
很多人对使用快速替代方法的认知可能还简单的停留在“就比手工方法快”的水平上，实际上并不只是如此。
使用快速方法的意义还在于：
1. 实验结果具有高度的可重复性，所有参数可控，标准化操作流程，让结果高度重现。
2. 降低出错几率，人工连续的机械性操作步骤越多出错的风险就越大。
3. 帮助将时间投入到更高价值的工作中，从机械性重复性的劳动中解放出来。
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