突发新型冠状病毒（2019 novel coronavirus，2019-nCoV）肺炎疫情以来，感染病例快速上升。随着疫情的发展和防控力度加大，全国各地乃至境外均有病例报道[1,2,3,4]，及时对急重症及疑似患者进行诊断需要快速有效的方法，病毒核酸检测可为诊断提供直接证据[5,6]。核酸检测过程中因对病原体的传染途径和致病力尚未完全明确，工作人员在核酸检测过程中存在较大的感染风险。此外，因为2019-nCoV基因结构与一般RNA差别较大，因此检验流程、检验质量和生物安全均需要有一定的指导。本共识在参阅国家卫生健康委员会相关文件、查阅文献、咨询重疫区相关专家的基础上进行编写，以对实验室检测工作提出有指导性的建议，本共识适用于从事2019-nCoV核酸检测的所有实验室。

　　

　　适用范围

　　

　　适用于2019-nCoV核酸检测，如采用逆转录PCR（RT-PCR）方法检测等。

　　

　　工作程序

　　

　　一、标本采集

　　

　　（一）标本采集人员

　　

　　采集人员必须经过院感管理部门或上级管理部门举办的生物安全培训，并考核合格。标本采集人员应按三级防护配备防护用品，包括工作服、防护服、一次性工作帽、医用防护口罩（N95）、外科口罩、护目镜、面罩、双层手套、防水靴和鞋套[7,8]。配备防止病原微生物扩散和感染的设施，如处理感染性废弃物的垃圾桶、处理紧急意外事件的药具和具备一定的通风条件等。

　　

　　（二）受检人群

　　

　　新型冠状病毒肺炎疑似病例、确诊病例或与上述二者有密切接触史者[9]。

　　

　　（三）标本采集及包装

　　

　　轻症患者、高度疑似患者或有密切接触史者，标本采集优选顺序为鼻咽拭子、口咽拭子、痰液，为提高阳性率，可同时采集1份鼻咽拭子和1份口咽拭子于同一标本采集管中；为观察疗效和控制传染源，可对确诊患者的粪便和血液进行检测。

　　

　　1．鼻咽拭子：

　　

　　标本采集管先贴好条形码，尽可能采集患者发病3 d内的鼻咽拭子标本。以拭子测量鼻尖到耳垂的距离并用手指做标记，将拭子以垂直鼻子（面部）方向插入鼻腔，拭子深入距离最少应达耳垂部位到鼻尖长度的一半，使拭子在鼻内停留15~30 s，轻轻旋转3~5次，迅速将拭子放入装有2 ml裂解液（与核酸提取试剂盒中裂解液相同）的标本采集管或含RNA酶抑制剂的细胞保存液中，插入拭子后在靠近顶端处折断无菌拭子杆，旋紧管盖并用封口膜封闭[10]。

　　

　　2．口咽拭子：

　　

　　标本采集管先贴好条形码。尽可能采集发病3 d内患者的咽拭子标本。宜用无菌植绒拭子采样，适度用力拭抹咽后壁部位，应避免触及舌部；迅速将无菌拭子放入用于采集鼻咽拭子的采集管中，在靠近顶端处折断无菌拭子杆，旋紧管盖并用封口膜封闭[10]。

　　

　　3．痰液：

　　

　　标本采集管先贴好条形码。收集痰液标本时不宜开放气道收集标本。收集深部咳嗽痰液于一次性无菌旋盖采样杯中，采样杯中装入2 ml蛋白酶K（1g/L)[11]。收集痰液后旋紧杯盖并用封口膜封口，尽可能30 min内送检。如果需长距离运输标本时不宜先添加蛋白酶K。

　　

　　4．肺泡灌洗液（BALF）：

　　

　　重症患者或病情进展迅速的肺炎患者，由临床医生无菌操作下吸取≥5 ml BALF到贴有标本条形码并带螺帽的50 ml无菌容器中。收集标本后旋紧标本盖并用封口膜封口。

　　

　　5．血液：

　　

　　发病后7 d内或危重症患者，或考虑病毒血症患者，可采集血液标本。标本采集管先贴好条形码。使用含有乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝剂的真空釆血管采集血液标本2~4 ml。

　　

　　6．粪便：

　　

　　如发病早期出现腹泻等消化道症状的患者，则留取粪便标本3~5 g(黄豆大小)。标本采集管先贴好条形码。标本收集于含2 ml生理盐水（有条件时可添加RNA酶抑制剂）的带螺帽标本采集管中并用封口膜封口。

　　

　　7．标本包装：

　　

　　采集标本后用75%乙醇喷洒标本采集管外部，立即放入标有"生物危险"密封袋中并封严封口；再用75%乙醇喷洒密封袋外部，然后放入标本转运容器，并对转运容器进行外部消毒，及时送检。

　　

　　二、标本运输

　　

　　标本应送至具备检测资质并经省级卫生行政主管部门批准可从事2019-nCoV核酸检测的PCR实验室[12]。

　　

　　1．送检时间和温度控制：

　　

　　标本采集后应尽快送检，采集后应尽可能在2～4 h内送到实验室。在2 ～8 ℃下转运，运送时间应不超过72 h。如超过72 h，应-70 ℃或更低的温度下保存和转运。血液标本应分离血浆后进行保存和转运[9,13]。

　　

　　2．运输容器：

　　

　　标本运输容器应当防水、防破损、防泄露、耐高（低）温和高压。运输容器和包装材料上应有相关规定的生物危害标识、警示语和提示语。运输容器应使用三层包装系统，即内层容器、中层包装和外层包装。防漏的内层容器包装后贴上生物危害标识，装入中层容器，将"感染性物品"标记贴在外层包装上。内层容器和中层容器间应放置足量的吸水性材料，中层容器应固定在硬质外层容器中。中层容器与外层容器间应放置凝胶冰袋[9,14]。

　　

　　3．院内运输：

　　

　　标本运送人员进行二级防护并随身携带75%乙醇，以便发生意外时能及时处理，标本运送时宜派两人同行，条件允许时应配备标本转运监控装置。

　　

　　4．长距离运输：

　　

　　若标本需要远距离运输，应当按照《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》办理《准运证书》[15]。2019-nCoV标本运输包装属于A类，对应的联合国编号为UN2814。转运者安全防护按二级防护要求佩戴，并随身携带75%乙醇。司机佩戴外科口罩或N95口罩，通过专用车辆运输。如果经航空运输，包装还应符合国际民航组织文件Doc9284-AN/905《危险品航空安全运输技术细则》[16]的PI602分类包装要求[9]。至少由1名标本运送人员和司机同时转运标本，宜配备标本转运过程监控设施。

　　

　　三、标本接收

　　

　　1．生物安全防护：

　　

　　标本接收人员按二级防护佩戴防护设备。

　　

　　2．标本签收：

　　

　　标本运送人员和接收人员对标本进行双签收。接收标本前应检查标本转运容器外包装有无破损，打开容器前用75%乙醇对标本转运容器进行喷洒或擦拭消毒。将标本转运容器放入生物安全柜，在安全柜中打开标本转运容器并立即用75%乙醇喷洒或擦拭消毒，取出标本密封袋后，对密封袋用75%乙醇喷洒或擦拭消毒，并检查是否密封好，立即将标本放入专用冰箱冷藏保存[17]。

　　

　　3．标本接收后保存：

　　

　　标本接收后，若无法及时检测，可于4 ℃条件下短期（不超过24 h）保存，若需长期保存，可将标本于-70℃或更低的温度下保存[9]。

　　

　　四、试剂准备

　　

　　1．试剂选择参考意见：

　　

　　至少含2019-nCoV基因的两个位点（开放读码框1a/b、核壳蛋白N或E结构蛋白）[9]，反应体系大，加样量大；检测试剂最好能与核酸提取仪配套使用，此外可选用引物不同的试剂盒便于对结果复核。

　　

　　2．安全防护：

　　

　　建议按三级防护要求进行防护；当条件不允许且各工作区分工作业时，试剂配制人员至少应按《医疗机构临床基因扩增检验工作导则》[18]穿工作服，戴一次性医用帽子和手套。

　　

　　五、标本前处理

　　

　　标本前处理及核酸提取操作的工作人员应进行三级防护。标本前处理应在具有外排功能的生物安全柜中操作。生物安全柜中应配备两个废弃物桶，一只桶中装0.55%~1%含氯消毒液，另一只桶中装1 mol/L稀盐酸。前一只废弃物桶用于丢弃标本、实验过程中产生的废液及与标本接触过的实验耗材；后一只废弃物桶用于装接触过核酸的耗材。废弃物桶应完整并醒目地标示废弃物内容。每次对标本进行操作后，用75%乙醇消毒后弃去外层手套，对内层手套用75%乙醇消毒后更换新外层手套。取出标本后用75%乙醇对标本外部进行喷洒或擦拭消毒。

　　

　　（一）标本前处理

　　

　　1．口咽拭子和鼻咽拭子：

　　

　　可直接用于核酸提取，当实验室条件不够时可增加病毒灭活步骤[9]，增加病毒灭活步骤可能会降低核酸检测的灵敏度。

　　

　　2．血液：

　　

　　1 500×g离心10 min,，离心后冰浴3~5 min，吸取血浆提取核酸。

　　

　　3. 肺泡灌洗液和粪便：

　　

　　应充分振荡混匀后进行病毒灭活。

　　

　　4. 痰液：

　　

　　先在55 ℃下孵育15 min后再进行病毒灭活[11]。如果痰液标本采集杯中没有预加蛋白酶K，则应在病毒灭活后重复此步骤。

　　

　　（二）病毒灭活

　　

　　提前将水浴箱预热至56 ℃，在生物安全柜内用75%乙醇对装有标本的密封袋进行喷洒消毒，用吸水纸擦拭后放入水浴锅中的试管架上，标本盖上搁置重物，防止标本采集管漂浮。每隔10 min将标本摇匀1次（动作轻柔），灭活时间45 min[19,20]。可根据提取试剂在标本裂解时所采用的温度调整灭活温度，但不能低于56 ℃；提高温度后可适当缩减灭活时间。灭活条件的优化最好有预实验支持，保证标本能在有效温度下有足够时间灭活。

　　

　　六、核酸提取和加样

　　

　　1．实验前消毒：

　　

　　用75%乙醇对生物安全柜的空间和台面以及核酸提取仪进行消毒，并紫外线照射30 min。有条件时可在生物安全柜操作台面铺一层吸水性材料[14]。

　　

　　2．标本准备：

　　

　　将灭活后的标本从水浴锅中取出，在生物安全柜内对密封袋进行消毒，打开密封袋后，即时用75%酒精消毒，取出标本，1 500×g离心5 min后冰浴3~5 min。在生物安全柜内打开标本采集管，按核酸提取试剂说明书要求吸取一定量标本（动作轻柔）加入核酸提取试剂中。为保证人员安全和核酸提取纯度和效率，建议采用基于磁珠吸附的自动化核酸提取方法。

　　

　　3．标本处理后消毒：

　　

　　采用75%乙醇对生物安全柜、工作台面、移液器等用品进行消毒[14]。

　　

　　4．核酸扩增体系的准备：

　　

　　核酸提取完成后，立即将提取物进行封盖处理。在生物安全柜内将提取核酸加至PCR扩增反应体系中。

　　

　　5．实验室消毒：

　　

　　用75%乙醇对核酸提取仪进行处理并紫外线照射30 min。应在实验室空气中喷洒75%乙醇，10 min后开启通风装置通风10 min（注意防爆，密闭空间如果通风不够，可适当延长通风时间），再开启实验室紫外灯照射30 min。紫外线照射后，工作人员可着一次性医用帽子、手套、隔离服、鞋套进入实验室，用1 mol/L的盐酸处理工作台面和地面，并开启实验室通风装置通风1 h后用清水清洁台面和地面[18]，最后可用过氧化氢消毒仪进行终末消毒[21]。

　　

　　七、核酸扩增

　　

　　1．安全防护：

　　

　　建议按三级防护要求进行防护，当条件不允许且各工作区分工作业时，扩增区工作人员可按二级防护佩戴防护用品，即穿隔离衣，戴一次性医用帽子、医用防护口罩（N95）、面罩、鞋套和单层手套。按试剂说明进行操作。

　　

　　2．核酸扩增：

　　

　　将扩增体系放入扩增仪，核对扩增程序是否与试剂说明书相符，启动扩增程序，待反应开始后离开实验室。

　　

　　3．扩增产物处理：

　　

　　扩增后产物置于含1 mol/L的稀盐酸中，应将产物全部浸泡至液体中，浸泡后将扩增产物转移出实验室[13]。如果扩增后产物未在扩增区浸泡稀盐酸，可将扩增产物用一次性医疗垃圾袋装好扎紧，转移至扩增产物废物处理区。

　　

　　4．实验室消毒：

　　

　　扩增完成后用75%乙醇对空气进行消毒，10 min后开启通风装置通风10 min，同样要注意通风的效果，防止密闭空气中酒精引发爆炸的危险，再用紫外灯照射30 min。紫外线照射后，工作人员着工作服、一次性医用口罩和帽子进入实验室，用1 mol/L稀盐酸擦拭台面和地面，清洁后应及时通风，通风时间不得少于1 h，再用清水清洁台面和地面[18]。

　　

　　结果解释

　　

　　一、报告方式

　　

　　建议报告为"检出"、"未检出"和"可疑"，对3种报告方式进行充分的结果解释，并对下一步工作提出建议。

　　

　　二、判读条件

　　

　　1．判读为"检出"的条件：

　　

　　需满足以下任一条：（1） ORF1ab和N基因同时阳性时，判定为阳性；（2）若仅ORF1ab或N基因其中之一检测结果阳性时，需重新提取原标本的核酸进行复查，复查后ORF1ab或N基因仍为阳性时，判定为阳性[9]。

　　

　　2．判读为"可疑"结果的处理：

　　

　　当出现以下两种情况时为"可疑"：（1）2个位点的Ct值位于阳性Ct值和阴性Ct值之间或其中1个位点判读为阳性，另1个位点的Ct值位于阳性Ct值和阴性Ct值之间（具体请参考试剂盒说明书）；（2）2个位点中的1个位点为阴性，另1个位点的Ct值位于阳性Ct值和阴性Ct值之间。对于"可疑"阳性结果，建议对标本重新进行一次核酸提取，并与该标本前一次提取的核酸同时扩增检测，结合两次检验，2个位点可判断为"阳性"则可报告"检出"，否则应报告"可疑"。当报告为"可疑"时，实验室应考虑以下措施：（1）更换不同厂家的试剂盒重复实验或采用敏感度更高的方法，如数字PCR方法进一步确定；（2）建议临床重新采集标本或更换部位采集标本再次检测。

　　

　　3．判读为"未检出"结果的处理：

　　

　　当两个位点扩增结果无反应，可报告"未检出"，并对结果进行解释，此情况可能是病毒载量低于检出限，应结合临床分析。当临床体征及其他检查高度怀疑2019-nCoV感染时，建议重新采集标本或更换部位采集标本再次检测。

　　

　　质量控制

　　

　　1．人员培训：

　　

　　标本采集人员应熟练掌握采集方法；实验室工作人员应准确掌握工作流程和操作。

　　

　　2．标本采集：

　　

　　标本采集管中如果加入了裂解液或蛋白酶K，应注意有效期和保存条件符合要求。

　　

　　3．标本运输：

　　

　　标本要及时送检，院内运输最好在采集后30 min内，送检时标本包装容器中应放置含凝胶的冰块，并监测运输过程中的温度。

　　

　　4．标本接收与处理：

　　

　　标本接收后应及时处理，特别是痰液和口/鼻咽拭子，因为这些标本中加入了痰液液化剂或裂解液，操作时间延长将导致核酸的降解。

　　

　　5．质控品的使用：

　　

　　试剂盒中阳性质控品/对照品应及时取出，放置于标本制备区的冰箱中。可将阳性样本的核酸分装冻存，用作阳性对照以验证试剂的有效性。实验室条件允许的情况下，可将阳性标本灭活后当成阳性质控品使用，阳性质控应选用浓度相对较低的标本。

　　

　　6．设置充分的对照：

　　

　　包括试剂对照、阴性对照和阳性对照。阴性对照可选用无菌水，每天实验结束后配制3~5份无菌水（2 ml试管加入无菌水）分别放置于标本制备区和扩增区，用于实验室污染控制。阴性对照和质控品均应与标本平行操作。

　　

　　7．正确使用75%乙醇：

　　

　　在实验过程中应合理减少75%乙醇的使用量，在操作过程中不能采用75%乙醇对空气消毒。

　　

　　8．降低气溶胶形成风险：

　　

　　标本前处理过程中动作应轻柔，减少气溶胶形成。

　　

　　9．优化工作流程：

　　

　　操作过程合理会节省时间，可减少核酸降解；因三级防护装备穿戴和更换比较费时，进行2019-nCoV核酸检测宜分工合作，以避免各室间核酸污染。

　　

　　10．室内质控方法：

　　

　　在检测一定数据后可依据本实验室阳性率进行控制，依据二项式分布计算阳性概率，制作P控制图，当阳性率超过控制范围时应停止实验，查找原因，彻底去除污染后才能开展检测工作。

　　

　　废弃物处理

　　

　　1．人员要求：

　　

　　处理废弃物的人员必须经过院感科或上级管理部门举办的生物安全培训，取得培训合格证书，并具备相应的专业技能。

　　

　　2．感染性废弃物处理：

　　

　　与标本接触过的医疗废物，如tip头、采样管、小离心管（如EP管）等应用0.55%~1%含氯消毒液处理，用三层医疗废物包装袋（标有"感染性废物"）装好扎紧后转出实验区，经高压灭菌后按医疗废物处理[22]。防护服、鞋套、手套、口罩用75%乙醇消毒后收集于三层医疗废物包装袋（标有"感染性废物"）中。经高压后按医疗废物处理[22]。

　　

　　3．处理核酸的废弃物处理：

　　

　　标本提取与加样过程中与核酸接触过的材料，如tip头、EP管、核酸提取槽等浸泡于稀盐酸中，浸泡时间不少于1 h，浸泡后用医疗废物包装袋装好并扎紧，经高压后按医疗废物处理。

　　

　　4．核酸扩增产物终处理：

　　

　　建议扩增产物在专门的房间进行终处理，将浸泡于稀盐酸中的产物在稀盐酸液体中开盖，切记不能在空气中开盖，浸泡过核酸的盐酸用碱进行中和后可按医疗废水处理，扩增用的试管，如八联管经高压后按医疗废物处理。

　　

　　5．废弃物的安全管理：

　　

　　操作人员应及时处理废弃物，并做好登记。不得私自将废弃物带离实验区。

　　

　　（文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点）

　　

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