高效的人群检测，对主动监控诸如SARS-CoV-2 这样的病原体的传播是非常重要的，在降低传播方面提供了定量数据来支持决策者。在疫情开始的时候，COVID-19 几乎毫无例外地使用逆转录聚合酶链式扩增反应（RT-PCR）方法来检测，但是单纯依赖一种技术是有明显劣势的。这种在世界范围对RT-PCR 方法前所未有的需求，导致检测和其他必要试剂的长期短缺，限制了检测容量。

　　

　　与基于PCR 的检测相比，质谱检测显著更加具有特异性，要求一个更宽的视角去处理不同的样本基质和仪器技术。因此，根特大学（Ghent University）的研究人员发起了一项基于Cov-MS联盟协作方案，该联盟已经产生了一个通用的、广泛适用的基于质谱的分析方案，可以轻松地适应广泛可变的测试设施环境。

　　

　　研究者随后成立了一个协作联盟(MS-Cov)，由15 个学术科研和工业实验室组成，SCIEX等业界主要质谱供应商也在列。研究者利用SCIEX TripleTOF™ 6600+ 系统上采用SWATH® 采集方法获得的高分辨率质谱仪器数据，创建了一个独立于质谱仪器供应商的Skyline文档，其中17个肽段生物标志物来自公开数据中检测到的两个SARS-CoV-2结构蛋白，即重组核衣壳蛋白(NCAP_SARS2)和刺突蛋白(SPIKE_SARS2)。向该联盟的所有成员提供了Skyline文件，以及包含重组NCAP和SPIKE蛋白的样品试剂盒，以及阴性患者背景下的稀释系列。15个实验室共享来自4个不同仪器供应商的数据，这些数据被集中收集，并用于供应商独立的免费软件(Skyline)，以评估候选特征肽的最 终整体方案性能和适用性，我们建立了Cov-MS数字孵化器，开放的交流和数据共享将有助于将该分析方案转化为全 球不同的临床环境。所有补充数据均可在Cov-MS数字孵化器中获得。

　　

　　

　　图3. Cov-MS联盟报告(红色，图片引用自pubs.acs.org/jacsau) 。(A) 优化样品制备。比较不同的样本保存培养基、三氯 乙 酸(TCA)沉淀和15分钟的消化酶解(n = 5)。LogSumAUC的增加表示为对数转换。主要集中在三个优化方面：应用不同的酸沉淀策略，即用三氯 乙 酸(TCA)和盐酸(HCl)，将消化酶解时间缩短到15分钟，以及使用不同的保存培养基。虽然这些改变可以提高整体的信号(图3)，但最 好的策略还是通过相关多肽的MRM方法优化和消除离子抑 制或通过降低基质干扰以及实验条件更好。现在可以实现一个少于30分钟的完整样品制备工作流程。

　　

　　(B)不同样品制备耗材的比较。在标准的工作流程中，肽段在水中溶解并转移到弹簧内衬管(SI)样品瓶。使用全回收(QR)小瓶，并在溶剂中加入5%的乙腈(ACN)，可以提高溶剂中大部分肽段的信号，但在UTM中没有信号提升。底部的栏显示估计的整体增益归因于消耗品。

　　

　　图3. Cov-MS联盟报告(红色，图片引用自pubs.acs.org/jacsau) 。 (C)增加eSwab样品的样本载样量。由于eSwabs使用生理盐水作为保存液，增加柱上样品的量可能是有益的。因此，我们评估了将载样量增加5倍的影响，无论是否使用SPE。整体平均LogSumAUC增加2.3倍(虚线)，比如，信号增加了5倍，如果将样本分成5份，采用SPE策略 。也就是说，如果将5次50 μL的消化液浓缩到一个SPE柱上，至少可以相当于两个Ct值。自动化处理将使这一发现得到巩固和扩展，但是我们在这里提醒可能会有SPE过载现象。由于缺乏内部自动化处理方案，我们继续采用原来的操作过程，50 μL样品量和10 μL柱上进样时，不应采用SPE前处理。

　　

　　图3. Cov-MS联盟报告(红色，图片引用自pubs.acs.org/jacsau) 。(D) Cov-MS联盟内的数据采集。为了简化所有这些并行实验方案，研究者为联盟成员提供了详细的方法优化标准操作程序(SOP)、包含17个肽段(145 个MRM)的Skyline模板和Cov-MS试剂盒。这些试剂盒含有重组核衣壳蛋白NCAP和刺突蛋白SPIKE的消化液，以及来自健康供体的UTM背景的稀释液体，一式三份。重要的是，研究表明只有新一代串联四极杆质谱仪器，能够达到足够的灵敏度。此外，汇编数据结果证实了最初的假设，所选肽段是具有实验特异性的。这些初步结果表明，不同的供应商可以从不同的目标肽段中通过叠加提高灵敏度，即使是相同的MRM。一个突出的例子是RGEPQTQGNFGDQELIR肽，它在SCIEX仪器上特别有效，可能是因为相应的离子源更适合于多电荷的多肽。

　　

　　

　　研究者详细描述了Cov-MS联盟为建立一个稳定、灵敏的正交试验来诊确认SARS-CoV-2阳性所做的努力。为了能够跟踪每天进行的数百万次RT-PCR检测并与之保持一致，科学界的集体努力至关重要，这不仅仅是因为MRM检测以前很少被用于检测病毒。

　　

　　图5. MRM能力的预测。(A)理论上将Ct与MRM测定方法相关联的绝 对量。在完 美 的条件下(即质粒)，用内部RT-PCR检测10 μL样品中的10个基因组，Ct值为38；在Ct值为40时，检测2.5个基因组。假设每个病毒粒子携带300-350个核衣壳蛋白(NCAP)分子，可以很容易地计算出10 μL中NCAP分子的绝 对数量。表中突出显示的部分 (C) Ct和MRM检测之间潜在的实际相关性。通过增加32倍的上样量，富集目标可以产生5倍 Ct值的灵敏度。临床RT-PCR预期比质粒更高，MRM信号可能因为病毒样颗粒(VLPs)而更高，这一事实映证这一点。

　　

　　

　　基于液质工作流程的一个主要缺点是，数据采集不能在单个仪器上并行进行，而RT-PCR检测使用多孔板。然而，使用8分钟的梯度，一种仪器可以每天测量超过150名患者，通过多通道液相方案，这可以增加到每天500名患者。Cov-MS联盟的一名成员(Alderley analytics)还研究了2分钟梯度的应用，并表明当基质相对干净时，才可行，在没有并行方案的情况下，每台仪器每天可增加样本检测通量至600名患者。如我们的初步结果所示，在稳定同位素标记和抗肽段抗体俘获 (SISCAPA)等预先免疫富集的情况下，可以达到低至1分钟的梯度。至少从样品制备的角度来看，没有理由不能使用机器人自动化操作，就像RT-PCR制备一样。

　　

　　最近有一项突破性的技术，可以进一步提高产量，那就是声波激发质谱(AEMS)。SCIEX Echo™ MS系统，纳升液滴以每秒三个样本的速率从样品中喷射到仪器中，每个液滴可测量4个MRM离子对。这可能会预期每台仪器每天采样约30000名患者。

　　

　　下一期，COVID-19 检测3」，我们将介绍SCIEX 使用声波激发质谱开发的肽段定量方法的研究进展。

　　

　　如果，希望了解更多关于COVID-19质谱检测方法，SCIEX SWATH® 采集策略，SCIEX Echo™ MS系统，可以扫码留下您的问题，我们的产品专家会与您沟通。
 

 

　　参考文献与信息

　　

　　1. Cov-MS: A Community-based Template Assay for Mass-Spectrometry-based Protein Detection in SARS-CoV-2 Patients, JACS Au Article ASAP (2021); DOI: 10.1021/jacsau.1c00048；

　　

　　2. 获取有关比利时根特大学的药物生物技术实验室的更多信息，请访问https://www.ugent.be/fw/pharmaceutics/pharmbiotech/en

　　

　　3. 您可以在MedRXiv 上了解更多关于这个检测的更多信息，希望获得 Cov-MS 数据孵化器，请发送申请邮件至 covms@ugent.be

　　

　　4. 获取有关SCIEX TripleTOF™ 系统基于SWATH® 采集策略的更多信息， 请访问https://sciex.com.cn/technology/swath-acquisition

　　

　　5. 获取有关SCIEX Echo™ MS系统的更多信息，请访问https://sciex.com.cn/products/integrated-solutions/Echo-ms

 

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