脂溶性维生素是一类不溶于水，而溶于脂肪及非极性有机溶剂的维生素，包括维生素A、维生素D和维生素E等。维生素A、D、E是机体维持正常代谢和机能所必需的脂溶性维生素。
在婴幼儿及成人配方乳制品中，维生素A和维生素E通常添加量较高，受基质干扰较小，可直接测定。但在限定条件下难以分离维生素E的4个异构体；而维生素D的添加一般较少，紫外吸收也相对较弱，同时受基质干扰严重，所以同时测定维生素A、D、E需做两次前处理，不仅步骤多、效率低，稳定性也差。
因此，现有的国家标准方法《GB5009.82-2016》采用液质联用或半制备正相净化的方式对其进行分离检测。但是液相色谱质谱联用方法不仅操作复杂，维护成本相对昂贵，且对实验员要求较高，普通的质量控制以及检测类实验室通常较难实现；而正相方法只能分开测定维生素A、D、E。所以需要两台仪器进行兼顾，不但成本高、易受流动相等条件影响，同时检测过程繁琐、耗时长。
在线SPE二维液相色谱法分析乳制品中维生素A、D、E
作为全球领先的分析仪器制造商，沃特世不仅提供性能优异的产品，解决方案的开发同样出色。本方案从以下4方面入手，创新性地开发了在线SPE二维液相色谱法分析乳制品中的脂溶性维生素A、D、E。
01
简化维生素D分析的繁琐过程：
维生素D（麦角醇），在乳制品中主要存在两种异构体: 维生素D2（麦角钙化醇）、维生素D3（胆钙化醇），其中维生素D3生理活性强于维生素D2。
02
需要对维生素A进行异构体分析：
维生素A（视黄醇），在乳制品中主要存在的异构体: 全反式视黄醇、13-顺式视黄醇。
03
对维生素E的4种生育酚异构体和4种三烯生育酚异构体的分析：
维生素E（生育酚和三烯生育酚）主要存在5种异构体：生育酚: α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、α-三烯生育酚。天然的生育酚与合成的生育酚存在手性上的差别。
04
简化脂溶性维生素A、D和E分析的预处理过程：
在线SPE二维液相分析的仪器配置和工作流程如图1所示：
图1. 在线SPE二维液相色谱仪器配置和工作流程图
本系统采用了3个泵、1个进样器、1个检测器、1个色谱柱管理器和1个SPE切换阀的配置，显著节省了所需成本。一维和二维共用一个检测器，节约成本的同时，所有信号产生在同一张色谱图上，方便数据处理和数据阐述。另外，在线SPE采用卡套式结构，其柱芯可拆卸和更换，降低了维护难度和使用成本。
在线SPE二维液相分析乳制品中维生素A、D、E的参考色谱条件
01
仪器：
ACQUITY Arc
02
方法：
色谱柱与色谱相
在线SPE: Waters HLB 2.1x25 mm带柱套固相萃取柱；
一维(维生素A、D、E): PFP 4.6x150 mm, 3 μm；H2O:MeOH=5:95；
二维(维生素D2和维生素D3): PAH 2.1x100 mm；H2O:CAN=4:96；
二维(维生素A异构体): PAH 4.6x100 mm, 3 μm, H2O:MeOH=15:85或者OD 4.6x150 mm，MeOH:H2O=20:80；
二维(维生素E手性分离): 4.6x150 mm，3 μm；H2O:MeOH=18:82。
梯度条件
一维梯度条件
二维梯度条件
实验结果
01 维生素A、D、E标准品测试：
图2. 维生素A、D、E标准品的在线SPE二维液相分析结果
从图2可以看出，采用在线SPE技术，可以实现样品皂化液的直接上样分析，极大地简化了样品前处理流程，满足实验室日常检测的高通量需求。同时，沃特世独特的Oasis HLB固相萃取填料作为在线SPE的柱芯，非硅胶基质的聚合物特性能够耐受极高pH值皂化液的反复进样而保持性能的稳定性。
02
乳制品中维生素A、D、E生物活性异构体的分析
在实际乳制品检测中，我们发现维生素A、D、E的浓度水平差距较大，同时检测似乎没有必要。此外，我们将目光集中在那些更感兴趣、且相对生物活性较高的异构体上。为此我们在这套在线SPE二维液相色谱系统上，用相同的配置进行了3组不同的方法学考察。
配方奶粉中维生素D2和D3的分析
图3. 配方奶粉中维生素D2和D3的在线SPE二维液相分析结果。
在图3中，从一维谱图上的基质干扰峰可以看出在线SPE的脱碱、脱脂效果明显。而在二维谱图中，通过中心切割可以显著去除基质干扰物，获得非常低的基线噪声，从而得到最 低的检出限。
牛乳中维生素A活性成分的分析
图4. 牛乳中维生素A活性成分的在线SPE二维液相分析结果。
全反式 - 视黄醇和13 - 顺式视黄醇是维生素A的主要活性成分，所以只需分析这两种异构体。从图4可以看出，维生素A出峰时间相对较早，共流出的基质较多，在线SPE结合二维中心切割能够有效去除干扰，实现分离的同时得到准确的结果。
同时分析营养强化奶粉中维生素A和E的相关活性成分
图5. 营养强化奶粉中维生素A和E相关活性成分的在线SPE二维液相分析结果。
营养强化奶粉中的维生素A和E共有7个活性较大的组分，达到完全色谱分离是检测的基础。由图5可见，采用沃特世在线SPE二维液相系统可以完全分离出这7个活性较大的组分。
总结
沃特世在线SPE二维液相色谱系统的技术特点：
Trap捕集柱取代Loop环存储样品，非常容易实现在线稀释、转换溶剂和增加质谱适应性等多种功能；
目标组分在捕集柱上的每次重新聚集和反冲，使得目标物峰不会因为色谱柱维度增加而扩散，理论上可实现N维液相分析。
配置灵活
二维到UPLC二维，多款高性能液相色谱仪可选；
从二元溶剂管理器(BSM)到四元溶剂管理器(QSM)，多款溶剂管理器可选；
从一维二维到多维可自由搭配，且软件可控。
配套化学消耗品齐全
XBridge、HLB等多种Trap柱可选；
HLB可全pH范围耐受，特别适合脂溶性维生素的皂化液样品在线SPE处理；
可替换的HLB柱芯及卡套大大地降低了在线SPE消耗成本。