活细胞内容物提取技术概览
2017年4月28日发表于NANOTECHNOLOGY杂志。
最新的贴壁活细胞提取技术——Cytosurge多功能单细胞显微操作系统FluidFMBOT
当今，对细胞内表达物的监控对于研究细胞分化、细胞衰老以及细胞病变、药物代谢等领域中发挥着越来越重要的作用。本文将对常用的几种活细胞提取技术进行概括
为什么要进行活细胞提取？
在传统的细胞提取技术中往往使用化学、生物学方法将细胞裂解，使细胞内容物渗出从而达到提取目的。但这类方法必须破坏细胞本身，在进行时效研究中，往往要将细胞分组分时处理，这类方法始终无法克服由于细胞异质性带来的误差。[1,2]
全新的活细胞提取技术解决了这一问题。这种技术使用微型注射器能够从细胞的特定部位每次仅提取极少量的胞质或者胞核（pL级），从而保证细胞活力的同时获得足够分析的细胞质或者细胞核，实现对同一细胞不同时间点变化的监测，克服传统法中由于细胞异质性带来的误差。[1,3]
活细胞提取的4种常用技术
1.纳米拖网
这项技术由Cao等人[2-5]的实验室建立。在他们的实验中，他们将150nm直径氧化铝管制成纳米拖网。随后将细胞种植在这种拖网表面。通过这些管道能够将贴在表面的细胞膜刺破，从而让细胞内容物渗入到下层的提取缓冲液中，这一方法能够使约7%内容物渗透入缓冲液中。他们指出这种方法得到的提取液能够用于荧光蛋白、酶测定以及PCR等试验。在他们研究中发现使用这种纳米拖网对iPSc诱导心肌细胞的中mRNA的提取分析实验中。他们成功分析出44个mRNA序列，而用传统裂解方法仅能够分析出7个。
2.细胞微注射玻璃针
细胞微注射玻璃针主要用于对大细胞进行注射。这种方法主要是用0.5~5μm的玻璃管直接从细胞内抽取内容物。然而这种方法往往会造成细胞损伤，因此目前也有实验室开发出100nm的注射针进行提取。[4,6,7]Actis等[4]使用离子电导显微镜结合微注射玻璃针建立了fL级细胞内容物提取方法。在这种方法中他们使用一种含有有机相的微注射玻璃针，通过压力来移动有机相从而实现提取。他们所建立的方法能够仅提取HeLa细胞内的RNA、线粒体DNA表达物而不提取任何细胞器。
3.FluidFM
流体力显微镜使用中空的原子力探针，通过力学探测精准可控的刺穿细胞膜。随后通过对尖端施加负压从而提取细胞。Guillaume-Gentil等报告指出，使用这项技术提取高达90%的细胞胞质的极端条件下，细胞在5天内仍保持较高活力。另外他们还使用该技术同时对细胞核和细胞质进行提取并进行酶测定和PCR实验取得成功。[1,8]
4.碳纳米管
碳纳米管目前主要应用于低损伤细胞监控中。Singhal等人将50μm长的多壁碳纳米管的末端与微孔玻璃管相连，从而提取胞浆中荧光标记的Ca离子。但是目前该方法提取的体积很小，其应用仍然受到限制。[5]
总结：
尽管当下有许多其他方法可以评估细胞内环境，包括荧光标记、量子点、纳米粒子，FRET，热敏荧光标记抗体或RNA。这些方法能够提供高特异性、高对比度和高分辨率，但是都只能识别少量预先设定的目标，无法全面监测细胞内环境变化。同时外源材料的引入也存在着对细胞活力产生不利影响的风险。[3]
相比之下，细胞活体提取技术有着这些方法无法比拟的优势。这种技术能够在全面的监测细胞内环境变化的同时，还能够尽可能的维持内环境稳定。本文所介绍的4种技术也有各自的优缺点：纳米拖网能够提供较大的细胞提取量，但是无法选择所需提取的细胞，并且对于不同细胞的提取量差异较大。而细胞微注射玻璃针操作复杂，所需使用的玻璃针会直接影响注射品质。FluidFM技术使用方便，能够准确定位，但该项技术较新，目前使用人数不多。碳纳米管目前仍受制于其提取量的制约，仍有待发展。[9-10]
参考文献
[1]O.Guillaume-Gentiletal.,Cell166,506(2016).
[2]Y.Caoetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.114,E1866(2017).
[3]J.Liu,J.Wen,Z.Zhang,H.Liu,Y.Sun,Microsys.Nanoeng.1,15020(2015).
[4]P.Actisetal.,ACSNano8,546(2014).
[5]R.Singhaletal.,Nat.Nanotechnol.6,57(2011).
[6]W.Kang,R.L.McNaughton,H.D.Espinosa,TrendsBiotechnol.34,665(2016).
[7]Y.Nashimotoetal.,ACSNano10,6915(2016).
[8]A.Meisteretal.,NanoLett.9,2501(2009).
[9]C.Chiappinietal.,Nat.Mater.14,532(2015).
[10]A.M.Xuetal.,Nat.Commun.5,8(2014).