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明胶酶谱法怎样操作?
时间:2019-05-13 09:45  浏览:243
  原理:

  Ø酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE,含0.1%明胶)电泳分离,然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性,在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶,最后用考马斯亮蓝将凝胶染色,再脱色,在蓝色背景下可出现白色条带,条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。

  复性原理:在电泳过程中,SDS与样品中的MMPs结合(当然是可逆性结合),破坏其氢键、疏水键而使MMPs不能发挥其分解明胶的作用,而只有当将胶置Trition中洗脱(最好是放在摇床上摇,30min/次,做2次或15min/次,4次。静置于Trition中是不妥的。)时,由于SDS被Trition结合而去除,从而使MMPs恢复了活性。

  试剂的配制

  (1)配制10%SDS聚丙烯酰胺凝胶(含1.0mg/ml明胶,配好后1周内使用,明胶含量低灵敏度高)

  A.分离胶的配制(注:根据你所用的电泳仪胶的大小确定配制胶的量)

  10%SDS聚丙烯酰胺凝胶10ml(包括)

  ddH2O4.5ml

  30%储备胶(0.8%BIS+29.2%丙烯酰胺)2ml

  1.5mol/lTris(PH8.8)2.5ml

  10%SDS100ul

  10%过硫酸铵(APS)100ul

  TEMED8ul

  1%明胶(1g明胶-->100ml,37°C水浴溶解)0.5ml

  B.浓缩胶的配制

  浓缩胶6ml

  ddH2O4.5ml

  30%储备胶0.75ml

  1mol/lTris-HCL(PH6.8)0.76ml

  10%SDS60ul

  10%过硫酸铵60ul

  TEMED6ul

  (3)5×Tris�甘氨酸电极缓冲液

  0.125mol/lTris-HCL,1.25mol/l甘氨酸,0.5%SDS(PH8.3)

  (4)4×上样缓冲液

  0.32%Tris-HCL6.4ml

  4%SDS(PH7.2)8ml

  16%甘油3.2ml

  溴酚蓝0.024g

  ddH2O2.4ml

  (5)洗脱液:2.5%TritonX-100,50mmol/LTris-HCl<6.057g/L>,5mmol/LCaCl2<0.5549g/L>,pH7.6(40分钟两次,中间换液)

  (6)漂洗液:50mmol/LTris-HCl,5mmol/LCaCl2,pH7.6(20分钟2次)

  (7)孵育液:50mmol/LTris,pH7.5,150mmol/LNaCl,10mmol/LCaCl2,0.02%NaN3(孵育42小时)

  (8)染色液:0.05%Coomassic亮蓝R-250,30%甲醇,10%乙酸(染色3小时)

  (9)脱色液A、B、C:甲醇浓度分别为30%、20%、10%,乙酸浓度分别为10%、10%、5%(分别30min、1h、2h脱色)

  实验步骤

  1.取对数期的癌细胞在的无血清培养基DMEM中培养24h。

  2.次日收集上清液,将上清液移入离心管中2000rpm离心10min,-70℃储存备用。

  3.根据细胞计数调整各组细胞培养上清液中的蛋白浓度(或者测定蛋白浓度调整使所上蛋白总量一致)。与5×上样缓冲液混合,13ul样本+4ul上样缓冲液。(不要用枪用力吹打,防止出现过多气泡)

  4.配制分离胶和浓缩胶,16ul/孔上样(根据表达强度和蛋白浓度确定上样量),4℃进行SDS-PAGE电泳100v约1.5小时(电泳时在周围敷上冰,有利于使条带跑直)。

  5.电泳结束后,将凝胶置于洗脱液(2.5%TritonX-100,50mmol/LTris-HCl,5mmol/LCaCl2,pH7.6)中振荡洗脱2次,每次40分钟,然后用漂洗液(除不含TritonX-100外其余同洗脱液)漂洗2次,每次20分钟,接着,将凝胶置于孵育液(50mmol/LTris-HCl,5mmol/CaCl2,0.02%Brij-35,pH7.6)中37℃孵育42h。

  6.孵育结束后经染色液(0.05%Coomassic亮蓝、30%甲醇、10%乙酸)染色3h,及脱色液A、B、C(甲醇浓度分别为30%、20%、10%,乙酸浓度分别为10%、10%、5%)分别脱色0.5、1、2h后,显示出MMP-2(72KD)和MMP-9(92KD)为位于蓝色背景上的透亮带,用凝胶图像分析系统分析读取条带面积,宽度和灰度值,做统计分析。

  注意事项:

  1.制备聚丙烯酰胺时应注意排除气泡。

  2.明胶酶谱的活性受钙离子,锌离子,和PH值等因素的影响,因此缓冲液配制应严格准确,尽量用超纯水,孵育温度也掌握好。

  3.用大梳子

  4.孵育液的PH最好在7.5-7.6,复性的TRITON时间长了会有絮状物,所以实验时尽量使用新鲜配置的。

  5.孵育的37度不要在CO2培养箱中,因为会改变孵育液的PH值,在普通孵箱即可。

  6.明胶要4度保存,配好后1周内使用

  凝胶制备:

  1.玻璃板对齐后放入夹中,垂直卡紧,加满水检漏。

  2.配10%分离胶,APS和TEMED作用为促凝,最后灌胶前加。若板不漏水,则将水倒出,并用吸水纸洗净后灌胶,灌至大约3/4处,上面加满水压平。

  3.配浓缩胶,同样地,APS和TEMED最后加,分离胶灌入约30min后观察小烧杯中剩余分离胶是否已凝,同时仔细观察可见玻板水和胶间有一条折线,说明胶已凝固。

  4.将上面的水倒去,吸水纸洗净,灌入浓缩胶,灌满,注意一定不要有气泡,然后将梳子插入,注意保持水平,约30min后凝固可用。

  5.拔梳子在电泳缓冲液中拔,加样孔用小针筒冲洗干净再上样,注意上样时勿使样品逸至邻孔,样品混匀时要轻,不要产生气泡,否则加样时易导致逸出而使结果不准确。

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