酮体是在肝细胞线粒体中生成的，其生成原料是脂肪酸β-氧化生成的乙酰CoA.首先是二分子乙酰CoA在硫解酶作用下脱去一分子辅酶A，生成乙酰乙酰CoA。
在3－羟－3－甲基戊二酰CoA（hydroxymethylglutarylCoA，HMGCoA）合成酶催化下，乙酰乙酰CoA再与一分子乙酰CoA反应，生成HMG-CoA，并释放出一分子辅酶。这一步反应是酮体生成的限速步骤。
HMG-CoA裂解酶催化HMG-CoA生成乙酰乙酸和乙酰CoA，后者可再用于酮体的合成。
线粒体中的β－羟丁酸脱氢酶催化乙酰乙酸加氢还原（NADH+H+作供氢体），生成β-羟丁酸，此还原速度决定于线粒体中[NADH+H+]/[NAD+]的比值，少量乙栈酸可自行脱羧生成丙酮。
上述酮体生成过程实际上是一个循环过程，又称为雷宁循环（lynencycle），两个分子乙酰CoA通过此循环生成一分子乙酰乙酸。
酮体生成后迅速透过肝线粒体膜和细胞膜进入血液，转运至肝外组织利用。