血浆凝血酶原时间测定(prothrombintime,PT)
二、检验方法名称:
凝结法
三、方法学原理:
在确定量的血浆样本经过一定时间的加温后,加入试剂。加入试剂后,采用波长为660nm的光照射样本。凝血过程(纤维蛋白原转化为纤维蛋白)中血的浑浊度可以通过测量散射光光强度的改变来测定。从散射光光强度的测定,可以做出凝血曲线,通过PercentageDetectionMethod法求得凝血时间。
四、方法学溯源:
凝血酶原时间(PT)测定是Quick于1935年创立的。在受检血浆中加入过量的组织凝血活酶(人脑、兔脑、胎盘及肺组织等制品的浸出液)和钙离子,使凝血酶原变为凝血酶,后者使纤维蛋白原转变为纤维蛋白。观察血浆凝固所需要的时间即凝血酶原时间。其凝固时间取决于凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅴ、Ⅹ、Ⅰ的水平。该试验是反映外源凝血系统最常用的筛选试验。
五、仪器:
(一)型号:SysmexCA—1500自动血液凝血分析仪
(二)分析和计算参数:
1.处理量:约120个测试/小时
2.所需样本量:50μl
3.检验时间:在最长检验时间之内测出结果,典型最长检验时间:100秒
4.重复性:CV≤2%
5.计算参数:凝血酶原活动度(PT%)
凝血酶原比值(PTR)
国际标准化比值(INR)
六、试剂及配套品:
(一)试剂:
1.凝血活酶含钙试剂(Thromborel®S)
(1)商标:德灵(DADEBEHRING)
(2)包装规格:Packfor10×4ml
(3)代码:No.OUHP29,or
(4)参数:ISI(国际敏感度指数)=0.97
(5)成分:
1)Thromborel®SReagent:
a.冻干人胎盘促凝血酶原激酶(lyophilizedhumanplacentalthromboplastin)
b.氯化钙(calciumchloride)
c.稳定剂(stabilizers)
2)防腐剂(Preservatives):
a.庆大霉素(Gentamicin)(0.1g/L)
b.5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(5-chloro-2-methyl-4-isothiazol-3-oneand2-methyl-4-isothiazol-3-one)(最大量20mg/L)
2.佛罗那巴比妥缓冲液(Dade®Owren'SVeronalBuffer)
(1)商标:德灵(DADEBEHRING)
(2)包装规格:Packfor10×10ml
(3)代码:B4234-25
(4)成分:
1)2.84×10²M的巴比妥钠(sodiumbarbital)
2)1.25×10¹M的氯化钠(sodiumchloride)
3)PH7.35±0.1
3.清洗液(Cleaning)
2%次氯酸钠溶液(自配)
(二)配套品:
1.标准血浆(StandardHumanPlasma)
(1)商标:德灵(DADEBEHRING)
(2)代码:No.ORKL
2.校准质控血浆(Ci-Trol®)
(1)商标:德灵(DADEBEHRING)
(2)代码:Level1,B4244-10
Level2,B4244-20
Level3,B4244-30
3.质控血浆(ControlPlasma)
(1)商标:太平洋(PacificHemostasis)
(2)代码及规格:Level1(Normal),10059510×1ml
Level2(Abnormal),10059610×1ml
Level3(Abnormal),10059710×1ml
七、操作步骤:
(一)开机:开机前,先打开连机的打印机。按下机器右边的POWER按钮。开机后机器进行自检,当屏幕上边显示“Ready”时可以进行试验。
(二)洗针:在主屏幕上选“RinseProbe”,然后按下“Execute”进行洗针。
(三)准备试剂:按照仪器试剂位置程序要求,把每一项的试剂准备好,放在相应的位置。(注:PT试剂的配制:在冻干粉试剂瓶中加入蒸馏水4ml,于37ºC温箱或水浴箱中放置30min)。
(四)准备标本:将室内质控和离心好的样本放在相应的样本架上(一个架子可放10个样本),准备好放在进样器上。
(五)准备反应杯:打开仪器上盖装反应杯的盖子,查看反应杯是否够量,需及时添加。
(六)输入试验项目:按下主菜单上的“WorkList”键,在试验项目键点击PT,使PT键由“—”变为“O”。如有需要按屏幕下的“Repeat”键,仪器会自动重复十个样本的检测项目与第一个样本相同。屏幕右边的光标移动键,按下“NEXT”表示翻到下一个界面,按“↑”表示向上移动光标,“←或→”表示下一个界面试验项目。
(七)输入样本号:按下“IDNo.Entry”,按顺序输入样本的序号或病人的病历号。
(八)开始检测:待一切准备工作就绪,按下仪器右上角“START”键,仪器开始工作。
(九)查看结果:返回主屏幕,检测的项目如果由“◎”变为“●”表明此试验已经完成,然后按下“StoredDate”(储存结果)键,屏幕会换到结果显示界面,检测的结果会自动传输到此画面,如果查看反应趋势图,按下边第一个菜单“Graph”,查看凝集趋势、吸光度、结果等。
(十)洗针:当做完一批标本以后,需要洗针,按下“RinseProbe”,然后按下“Execute”进行洗针。
(十一)关机:回到主屏幕下,在洗完针以后方可关机,切断电源,关闭打印机。
八、参考范围:PT(sec):11—14s
PT%:80%—120%
PTR:1±0.15
INR:0.8—1.5
九、临床意义:
(一)PT延长
1.外源凝血系统的因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ和纤维蛋白原减低,如先天性某因子缺乏症和低(无)纤维蛋白原血症,但均很少见,获得性的见于DIC、原发性纤溶、维生素K缺乏症、肝脏疾病等。
2.血循环中抗凝物质增加,如肝素或FDP增多等。
(二)PT缩短口服避孕药、高凝状态和血栓性疾病等。
(三)用于香豆素类等口服抗凝剂的监控
1.一般认为以维持PT值在参考值的2倍左右(1.3—2.5倍)即25—30s,或PTR为1.3—1.5(最大不超过2)为宜。
2.PT%应控制在40%以上,减低到40%有出血倾向。
3.不同情况下口服抗凝药治疗的最佳抗凝强度时INR的范围:
(1)术前两周或术中口服抗凝药,INR为1.5—3.0;
(2)原发或继发静脉血栓的预防,INR为2—3;
(3)活动性静脉血栓、肺梗塞、复发性静脉血栓的预防,INR为2—4;
(4)动脉血栓栓塞的预防,心脏换瓣术后,INR为3—4.5。
十、病人准备和标本要求:
(一)采血时,首先应该确认病人姓名,并且将姓名和编号写在真空采血管的标签处。
(二)尽可能保证每次采血都在同样的条件下进行,即病人处于休息状态,并且在早餐前采血。
(三)凝血实验标本最好不与其它实验一起采集,否则由于标本的分配、分装等而使血液停留在针管的时间延长。
(二)取血时,病人应松弛,环境温暖,防止静脉痉挛,止血带的压力应尽可能小,取血速度平稳顺利,防止产生气泡。,。
(三)用定量为3毫升的一次性枸橼酸钠(0.11mol/L)真空采血管采血至指定刻度,取血完毕立即轻轻颠倒混均混合均匀,不要剧烈震荡,并避免产生气泡。
(四)及时离心,3000转/分离心标本10分钟,以除去血小板。
(五)务必于采血后2小时内测定完毕,如不能完成试验,冷冻贮存少量血浆(0.5—1ml)(最好在-70℃,或者当贮存时间较短时,可以置于-20℃条件下),在实验前将血浆于37℃下快速融化。血浆用塑料试管存放,并用塑料吸管移取标本。
十一、操作注意事项:
(一)许多的实验误差都来源于技术的错误。在实验技术、试剂、温度及PH值上很小的变化都会导致试验结果明显的变化。孵育时间与温度是凝血酶原时间测定时应严格控制的参数。血浆绝不能在37°C下放置10min。