同位素标记是一种重要的抗体标记技术,牨977年Yalow等在放射免疫测定法所作突出贡献而获得医学和生理学诺贝尔奖。McAb标记同位素后除应用于放射免疫测定外,还可用于竞争结合试验、体内肿瘤定位等。
一原理
氯胺桾即对甲苯碘氯胺钠,在水溶液中生成次氯酸,为一种温和氧化剂,当加入到有蛋白质和碘的弱碱水溶液中,可将I2氧化为I+并结合到氨基酸上。如标记条件温和,标记后的McAb仍具有良好的结合活性,通过放射性同位素强度的测定可反映相应抗原的含量。
二方法
在细胞冻存管内加入纯化的McAb100μg/100μl,
再加入10μl0.05M磷酸缓冲液
再加入10μl含1mCi125I
↓
加入10μl氯胺-T5mg/ml溶于0.05M
磷酸盐缓冲液,孵育时间不超过30秒
↓
加入100μl偏重亚硫酸钠1.2mg/ml溶于
0.05M磷酸缓冲液
↓
加入200μlKI溶液少许结晶KI溶于0.05M
磷酸缓冲液+4%牛血清白蛋白
↓
用PD10柱SephadexG25除去游离125I
用4%BSAPBS洗脱
↓
分部收集,0.5ml/管
每管取5μl进行γ计数,计算标记抗体的比活性和标记率
结合于McAb125I放射性强度cpm
标记率%=───────────────────
总放射性强度cpm
结合于某一管McAb上的放射性强度
比活性μCi/μgMcAb=────────────────
某一管McAb总量
三试剂器材
1.纯化后的McAb
2.0.05M磷酸缓冲液,氯胺桾,偏重亚硫酸钠,KI,BSA
3.125I
4.有通风装置的超净台,γ计数仪
5.PD10柱SephadexG25
四注意事项
1.严防同位素污染,工作人员必须穿着工作衣,戴口罩、帽子、手套。必须在严密的通风橱或通风超净台中操作。操作前后对实验室环境进行监测。所用125I和标记物应妥善保管。
2.如标记细胞因子、激素等,应选用更温和的标记方法,使保持更好的生物学活性。