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125I标记单克隆抗体技术的知识点和注意事项
时间:2019-04-26 09:21  浏览:177
   125I标记单克隆抗体技术

  同位素标记是一种重要的抗体标记技术,牨977年Yalow等在放射免疫测定法所作突出贡献而获得医学和生理学诺贝尔奖。McAb标记同位素后除应用于放射免疫测定外,还可用于竞争结合试验、体内肿瘤定位等。

  一原理

  氯胺桾即对甲苯碘氯胺钠,在水溶液中生成次氯酸,为一种温和氧化剂,当加入到有蛋白质和碘的弱碱水溶液中,可将I2氧化为I+并结合到氨基酸上。如标记条件温和,标记后的McAb仍具有良好的结合活性,通过放射性同位素强度的测定可反映相应抗原的含量。

  二方法

  在细胞冻存管内加入纯化的McAb100μg/100μl,

  再加入10μl0.05M磷酸缓冲液

  再加入10μl含1mCi125I

  ↓

  加入10μl氯胺-T5mg/ml溶于0.05M

  磷酸盐缓冲液,孵育时间不超过30秒

  ↓

  加入100μl偏重亚硫酸钠1.2mg/ml溶于

  0.05M磷酸缓冲液

  ↓

  加入200μlKI溶液少许结晶KI溶于0.05M

  磷酸缓冲液+4%牛血清白蛋白

  ↓

  用PD10柱SephadexG25除去游离125I

  用4%BSAPBS洗脱

  ↓

  分部收集,0.5ml/管

  每管取5μl进行γ计数,计算标记抗体的比活性和标记率

  结合于McAb125I放射性强度cpm

  标记率%=───────────────────

  总放射性强度cpm

  结合于某一管McAb上的放射性强度

  比活性μCi/μgMcAb=────────────────

  某一管McAb总量

  三试剂器材

  1.纯化后的McAb

  2.0.05M磷酸缓冲液,氯胺桾,偏重亚硫酸钠,KI,BSA

  3.125I

  4.有通风装置的超净台,γ计数仪

  5.PD10柱SephadexG25

  四注意事项

  1.严防同位素污染,工作人员必须穿着工作衣,戴口罩、帽子、手套。必须在严密的通风橱或通风超净台中操作。操作前后对实验室环境进行监测。所用125I和标记物应妥善保管。

  2.如标记细胞因子、激素等,应选用更温和的标记方法,使保持更好的生物学活性。

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