检验检测技术
支原体培养的操作与方法
时间:2019-04-24 11:57  浏览:174
   支原体常用培养基为PPLO,很多公司都有出售.但血清(常用马血清或猪血清)和抗生素(醋酸跎)你要自己加.你可以查查.还有改良的Frey's培养基,常用的微生物实验技术书上都可以查到的。可以自己配制的。在液体培养基中通常要加入酚红做指示剂的,当培养基由红色变为黄色时,即可判定支原体的生长程度。要强调一点,支原体的分离可能不太容易,那么要多盲传几代。液体培养基变黄后,在固体培养基上单克隆,以纯化分离的菌。

   所有解脲,人型,肺炎,生殖道支原体培养基,均为液态,不知道homiao要分离哪种支原体,需要哪种支原体?

 1、培养:支原体的培养37℃即可,当然,初次培养37℃,5%-10%co2效果更好。其中,解脲支原体生长比较快,用我所培养基,接种量104-105ccu,培养16-18h即可达到对数生长期。人型,肺炎,24-48h即可达到对数生长期。

 2、鉴定:主要靠菌落染色、生化反应及特异性生长抑制试验等.

 (1)Dienes菌落染色Dienes染色液:美蓝2.5g天青-Ⅱ1.5g麦芽糖10g碳酸钠0.5g蒸馏水100ml

 染色时,直接吸染色液覆盖菌落,1min后,用生理盐水洗去染色液,低倍镜下可见支原体菌落呈蓝色,而其他菌菌落不着色。

 (2)生化反应

  根据不同采样部位及对底物的分解或者作为能源,可以鉴别不同支原体。

  解脲支原分解尿素不分解精氨酸,生成NH3使培养基的ph升高,酚红指示剂变红。

  人型支原体分解L-精氨酸不分解尿素,生成NH3使PH值升高,酚红指示剂变红。

  肺炎和人型支原体分解葡萄糖,使pH降低,酚红指示剂由红变黄。

  (3)在含0.002%美蓝的培养基中肺炎支原体能生长且将美蓝还原而退色,其他口腔、唾液或发酵支原体均被抑制生长,此法可鉴定肺炎支原体。

  (4)分子生物学鉴定

  由于支原体的基因文库已建立,通过pcr扩增和基因探针技术可以对支原体进行鉴定。

  如果要自己配制培养基,现提供几种配方:

  基础培养基:Hayflick培养基(PPLO培养基),牛心粉50g蛋白胨10g氯化钠5g加14g琼脂粉为固体培养基

  (1)肺炎支原体培养基

  基础培养基70ml牛血清(灭活)20ml25%的酵母浸液10ml50%葡萄糖1-2ml0.4酚红0.5ml制霉素0.001g青霉素10万IUpH7.8

  (2)人型支原体培养基

  基础培养基70ml马血清20ml25%的酵母浸液10ml30%L-精氨酸0.33ml0.4%酚红0.5ml制霉素0.001g青霉素10万IUpH6.3

  (3)解脲支原体培养基

  基础培养基70ml马血清20ml25%的酵母浸液10ml30%尿素0.33ml0.4%酚红0.5ml制霉素0.001g青霉素10万IUpH6.0

  注:由于支原体能在人工培养基上生长,但是营养要求较高,需要提供胆固醇和酵母才能生长。以上配方中,马(牛).血清提供胆固醇,酵母浸液提供酵母。

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