（1）在肉膏蛋白胨斜面试管上，用记号笔写上将接种的菌名、日期和接种者。
（2）点燃酒精灯或煤气灯。
（3）将菌种试管和待接种的斜面试管，用大拇指和食指、中指、无名指握在左手中，并将中指夹在两试管之间，使斜面向上，成水平状态，。在火焰边用右手松动试管塞，以利于接种时拔出。
（4）右手拿接种环通过火焰烧灼灭菌（参照实验一），在火焰边用右手的手掌边缘和小指，小指和无名指分别夹持棉塞（或试管帽），将其取出，并迅速烧灼管口。
（5）将灭菌的接种环伸入菌种试管内，先将环接触试管内壁或未长菌的培养基，达到冷却的目的，然后再挑取少许菌苔。将接种环退出菌种试管，迅速伸入待接种的斜面试管，用环在斜面上自试管底部向上端轻轻地划直线，勿将培养基划破，也不要使环接触管壁或管口。
（6）接种环退出斜面试管，再用火焰烧管口，并在火焰边将试管塞塞上。将接种环逐渐接近火焰，再烧灼。如果接种环上沾的菌体较多时，应先将环在火焰边烤干，然后烧灼，以免未烧死的菌种飞溅出污染环境，接种病原菌时更要注意此点。
二、液体培养基接种
向肉膏蛋白胨液体培养基中接种少量菌体时，其操作步骤基本与斜面接种时相同，不同之处是挑取菌体的接种环放入液体培养基后，应在液体表面处的管内壁上轻轻磨擦，使菌体从环上脱落，混进液体培养基，塞好试管塞后，摇动液体，使菌体在液体中分布均匀，或用试管振荡器混匀。
向液体培养基中接种量大或要求定量接种时，可将无菌水或液体培养基注入菌种试管，用接种环将菌苔刮下，再将菌种悬液以无菌吸管定量吸出加入，或直接倒入液体培养基。如果菌种为液体培养物，则可用无菌吸管定量吸出加入或直接倒入液体培养基。整个接种过程都要求无菌操作。
三、穿刺接种
用接种针挑取菌种（针必须挺直），自培养基的中心垂直地刺入半固体培养基中，直至接近管底，但不要穿透，然后沿原穿刺线将针拔出，塞上试管塞，烧灼接种针。
上述几种接种法的无菌操作，凡未叙述的均按实验一操作。试验者应反复练习无菌操作接种技术，直至较熟练地掌握。
四、将已接种的斜面、液体和半固体培养基放置28—30℃温箱，培养2—3天后取出观察结果。