一、测定波长目前国内常见的ELISA试剂盒所使用的标记用酶均为辣根过氧化物酶(HRP)，底物通常为四甲基联苯胺(TMB)和邻苯二胺(OPD)，其在过氧化氢溶液的存在下，经HRP作用，分别氧化为2,2,-二氨基偶氮苯(DAB)和联苯醌。当pH值为5.0左右时，DAB在450nm波长处有吸收，当pH值降为L0时，吸收波长移至492nm,同时摩尔消光系数变大，显色加深，因而常用强酸如硫酸或盐酸终止反应。TMB的氧化产物联苯醌在波长450nm处有消光系数，如果HRP量少，H:O:和TMB过量时，则形成蓝色的阳离子根。降低pH,即可使蓝色的阳离子根转变为黄色的联苯醌，使用硫酸作为终止剂可使产物稳定90min.因此，450nm和492nm两个波长是目前ELISA测定常用的。各种酶标仪都配有放置滤光片的可自动转换的部件，可以同时安装6~8片滤光片，所配备的滤光片均应包括上述两个波长，有的酶标仪以490nm滤光片替代492nm滤光片，影响不大一般酶标仪的测定波长在400~750nm或800nm之间，完全可以满足ELISA的显色测定。。除了这两个基本滤光片外，考虑到双波长比色的需要，还应有620nm或630nm或650nm和405nm波长的滤光片，其他滤光片可根据自己的需要选择。有时，有的实验室希望用酶标仪作微量生化测定，故酶标仪生产厂家对其生产的酶标仪扩展了紫外检测功能，此时需要一个340nm波长滤光片。此时，酶标仪的测定波长范围就成为340-750nm或800nm。酶标仪有单波长和双波长检测功能有时使用者不知在什么情况下使用单或双波长检测。所谓的“单波长”就是使用一种对显色具吸收的波长即450nm或492nm进行比色测定；而“双波长”则除了用对显色具吸收的波长即450nm或492nm进行比色测定外，同时用对特异显色不敏感的波长如630nm进行测定，酶标仪打印出来的吸光度则为二者之差。630nm波长下得到的吸光度是非特异的，来自于板子上诸如指纹、灰尘、脏物等所致的吸收。因此，在ELISA比色测定中，使用双波长，且不必设空白孔。
二、测定的吸光度范围通常，酶标仪的吸光度测定范围在。0-2.5之间即可以满足ELISA的测定要求。早期的酶标仪可测定的吸光度一般在0-2.5之间，但现在基本上都做了拓宽，可达到3.5以上，并且能保持很好的精密度与线性。如Labsystems公司DragonWellscanMK-2的吸光度测定范围为0-3.5，而MultiskanAscent的吸光度测定范围(Abs)达0-4.0，在0-4.0范围，线性误差不超过±2.0%，在0.3-3.0吸光度范围内，测定精密度CV小于±0.2%；3.0-4.0Abs范围内，测定精密度CV小于士0.2%。因此，对于酶标仪的吸光度范围不必去刻意追求大的吸光度范围，主要要看在一定的吸光度范围内的线性和精密度如何。
三、光学系统酶标仪的光学系统采用的是垂直光路多通道(通常为8或12通道，亦有单通道)检测，一般为硅光管或光导纤维，除测定通道外，有的酶标仪还有一个参比通道，每次测定可进行自我校准。酶标仪的光学系统功能如何，均可通过酶标仪测定的吸光度范围、线性度、精密度和准确度等体现出来。光学系统好的话，则上述指标也应较佳。测定的精密度与测定通道之间的均一性有直接关系。单通道可避免因通道不同所致的差异。