杜仲叶为杜仲科植物杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)的干燥叶,收载于2015年版《中国药典》(一部),具有补肝肾､强筋骨的功能,可用于肝肾不足､头晕目眩､腰膝酸痛､筋骨瘘软等症的治疗｡杜仲是我国传统名贵滋补药材,传统药用部位为其树皮｡由于杜仲从种植到剥皮通常需要10年以上时间,周期较长,且剥皮后若养护措施不当,极易造成原植物死亡,仅以皮入药会严重影响杜仲资源的可持续发展｡据研究报道,杜仲叶有与杜仲皮相似的化学成分和药理活性,有望代替杜仲皮入药｡

　　

　　杜仲叶中的主要化学成分为京尼平苷酸､桃叶珊瑚苷､车叶草苷等环烯醚萜类成分,咖啡酸､绿原酸等苯丙素类成分,以及儿茶素､芦丁､异槲皮苷和紫云英苷等黄酮类成分｡据文献报道,京尼平苷酸､桃叶珊瑚苷等环烯醚萜类成分具有肝脏保护作用,京尼平苷酸可通过调节胆汁转运体功能起到保肝利胆的作用,桃叶珊瑚苷能够拮抗转化生长因子(TGF-β1)诱导人肝星状细胞(LX-2)活化及细胞外基质成分的表达,从而起到抗肝纤维化作用；芦丁等黄酮类成分可改善绝经后骨质疏松的骨微结构､增加骨密度,发挥抗骨质疏松的作用；绿原酸提取物则具有较强的抑菌和抗氧化作用｡2015年版《中国药典》(一部)中杜仲叶项下收载有绿原酸的含量测定项目,考虑到绿原酸并非杜仲叶专属活性成分,同时为综合考察杜仲叶中其他具有药理活性的成分,本研究采用高效液相色谱(HPLC)法同时测定了不同种植品种的杜仲叶中桃叶珊瑚苷､京尼平苷酸､儿茶素､绿原酸､车叶草苷､芦丁､异槲皮苷和紫云英苷等8种不同结构类别化学成分的含量,旨在为更全面地评价杜仲叶的质量提供参考依据｡

　　

　　1

　　

　　材料

　　

　　1.1 仪器

　　

　　Waters 2695型高效液相色谱仪,配置2996型二极管阵列检测器､柱温箱､Empower Ⅱ色谱工作站(美国Waters公司)；LIBROR-160DPT型万分之一天平(日本岛津公司)；AE240型十万分之一天平(瑞士Mettler Toledo公司)；HH-S6型电热恒温水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司)｡

　　

　　1.2 药品与试剂

　　

　　桃叶珊瑚苷对照品(批号:111761-200601,含量:>98%)､京尼平苷酸对照品(批号:111828-201604,含量:>97.4%)､儿茶素对照品(批号:110877-201604,含量:>99.2%)､松脂醇二葡萄糖苷对照品(批号:111537-201706,含量:>91.7%)均为含量测定用对照品,购自中国食品药品检定研究院；绿原酸(批号:2772,纯度:≥98.0%)､车叶草苷(批号:4883,纯度:≥98.0%)､芦丁(批号:5718,纯度:≥98.0%)､异槲皮苷(批号:5650,纯度:≥98.0%)､紫云英苷(批号:3975,纯度:≥98.0%)均购自上海诗丹德生物技术有限公司；甲醇､乙睛为色谱纯,其余试剂均为分析纯,水为超纯水｡

　　

　　1.3 药材

　　

　　不同种植品种的杜仲叶和杜仲(皮)由灵宝德汇生态科技有限公司提供,产地均为河南省灵宝市朱阳镇闫家驮基地(详见表1),经河南省中医药研究院都恒青研究员鉴定分别为杜仲科植物杜仲(E.ulmoides Oliv.)的干燥叶和干燥树皮,凭证标本存放于河南省中医药研究院中药室｡

　　

　　方法与结果

　　

　　2.1 色谱条件

　　

　　色谱柱:Agilent ZORBAX SB-C18(250mm×4.6mm,5μm)；流动相:乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B),梯度洗脱(0~7min,5%A；7~9min,5%A→8%A；9~28min,8%A；28~30min,8%A→20%A；30~42min,20%A；42~43min,20%A→50%A；43~63min,50%A；63~64min,50%A→5%A)；流速:1.0mL/min；柱温:35℃；检测波长:203nm(桃叶珊瑚苷,0~9.5min；儿茶素,19.5~21min)､239nm(京尼平苷酸,9.5~19.5min；车叶草苷,25.0~32.5min)､220nm(绿原酸,21~25.0min)､227nm(松脂醇二葡萄糖苷,32.5~34.5min)､354nm(芦丁､异槲皮苷,34.5~39.5min)､266nm(紫云英苷,39.5~60min)；进样量:5μL｡

　　

　　2.2 溶液的制备

　　

　　2.2.1 混合对照品溶液

　　

　　精密称取桃叶珊瑚苷､京尼平苷酸､儿茶素､绿原酸､车叶草苷､芦丁､异槲皮苷和紫云英苷的对照品各适量,置于同一量瓶中,加甲醇溶解并配制成上述成分质量浓度分别为406､219､22.4､441､48.4､32.2､24.0､7.2μg/mL的混合对照品溶液,即得｡

　　

　　2.2.2 杜仲叶供试品溶液

　　

　　取杜仲叶药材粉末(过三号筛,下同)约1g,精密称定,置具塞三角瓶中,精密加入50%甲醇25mL,称定质量,加热回流30min,放冷后再次称定质量,用50%甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液,即得｡

　　

　　2.2.3 杜仲皮供试品溶液

　　

　　取杜仲皮药材约2g,剪碎,精密称定,置具塞三角瓶中,加入三氯甲烷50mL,加热回流1h；取药渣,挥去三氯甲烷后连同滤纸再次置于三角瓶中,加甲醇50mL,称定质量,加热回流1h,放冷,用甲醇补足减失的质量；滤过,精密吸取续滤液25mL,水浴蒸干,残渣以甲醇溶解并定容至5mL,摇匀,即得｡