甘油冷冻保藏法
本方法适合于中、长期菌种保藏,保藏时间一般为2-4年左右.
(1)用火焰灭菌的接种环取斜面菌种在平皿上划线分离单菌落.
(2)平皿倒置于30℃或37℃恒温培养箱,培养24-48小时,至单菌落的大小为3mm左右.
(3)挑取一个单菌落,接种于一个装50mL的300mL三角瓶中30℃或37℃振荡培养10-15小时,至菌密度OD600为1.0-1.5.
(4)用火焰灭菌的接种环取少量种子液,涂片后,作革兰氏染色,在显微镜下观察菌体的形态,及是否有杂菌.
(5)按30%甘油:种子液为1:1(V/V)的量加入无菌甘油, 混合后分装至事先灭菌的菌种保存管(1-2mL/管),-70℃或液氮保存.
冷冻干燥保藏法
(1)准备安瓿管用于冷冻干燥菌种保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造,形状可用长颈球形底的,亦称泪滴型安瓿管,大小要求外径6-7.5mm,长105mm,球部直径9-11mm,壁厚0.6-1.2mm.也可用没有球部的管状安瓿管.塞好棉塞,1.05kg/cm2,121.3℃灭菌30分钟,备用.
(2)准备菌种,用冷冻干燥法保藏的菌种,其保藏期可达数年至十数年,为了在许多年后不出差错,故所用菌种要特别注意其纯度,即不能有杂菌污染,然后在最适培养基中用最适温度培养,使培养出良好的培养物.细菌和酵母的菌龄要求超过对数生长期,若用对数生长期的菌种进行保藏,其存活率反而降低.一般,细菌要求24—48小时的培养物;酵母需培养3天;形成孢子的微生物则宜保存孢子;放线菌与丝状真菌则培养7-10天.
(3)制备菌悬液与分装以细菌斜面为例,用脱脂牛乳2ml左右加入斜面试管中,制成浓菌液,每支安瓿管分装0.2ml.
(4)冷冻冷冻干燥器有成套的装置出售,价值昂贵,此处介绍的是简易方法与装置,可达到同样的目的.
将分装好的安瓿管放低温冰箱中冷冻,无低温冰箱可用冷冻剂如干冰(固体CO2)酒精液或干冰丙酮液,温度可达-70℃.将安瓿管插入冷冻剂,只需冷冻4-5分钟,即可使悬液结冰.
(5)真空干燥为在真空干燥时使样品保持冻结状态,需准备冷冻槽,槽内放碎冰块与食盐,混合均匀,可冷至-15℃.装置仪器,安瓿管放入冷冻槽中的干燥瓶内.
抽气一般若在30分钟内能达到93.3Pa(0.7mmHg)真空度时,则干燥物不致熔化,以后再继续抽气,几小时内,肉眼可观察到被干燥物已趋干燥,一般抽到真空度26.7Pa(0.2mmHg),保持压力6-8小时即可.
(6)封口抽真空干燥后,取出安瓿管,接在封口用的玻璃管上,可用L形五通管继续抽气,约10分钟即可达到26.7Pa(0.2mmHg).于真空状态下,以煤气喷灯的细火焰在安瓿管颈中央进行封口.封口以后,保存于冰箱或室温暗处.
此法为菌种保藏方法中最有效的方法之一,对一般生活力强的微生物及其孢子以及无芽胞菌都适用,即使对一些很难保存的致病菌,如脑膜炎球菌与淋病球菌等亦能保存.适用于菌种长期保存,一般可保存数年至十余年,但设备和操作都比较复杂.
滤纸保藏法
(1)将滤纸剪成0.5×1.2cm的小条,装入0．6×8cm的安瓿管中,每管1-2张,塞以棉塞,1.05kg/cm2,121.3℃灭菌30分钟.
(2)将需要保存的菌种,在适宜的斜面培养基上培养,使充分生长.
(3)取灭菌脱脂牛乳1-2ml滴加在灭菌培养皿或试管内,取数环菌苔在牛乳内混匀,制成浓悬液.
(4)用灭菌镊子自安瓿管取滤纸条浸入菌悬液内,使其吸饱,再放回至安瓿管中,塞上棉塞.
(5)将安瓿管放入内有五氧化二磷作吸水剂的干燥器中,用真空泵抽气至干.
(6)将棉花塞入管内,用火焰熔封,保存于低温下.
(7)需要使用菌种,复活培养时,可将安瓿管口在火焰上烧热,滴一滴冷水在烧热的部位,使玻璃破裂,再用镊子敲掉口端的玻璃,待安瓿管开启后,取出滤纸,放入液体培养基内,置温箱中培养.
细菌、酵母菌、丝状真菌均可用此法保藏,前两者可保藏2年左右,有些丝状真菌甚至可保藏14-17年之久.此法较液氮、冷冻干燥法简便,不需要特殊设备.
沙土保藏法
(1)取河沙加入10％稀盐酸,加热煮沸30分钟,以去除其中的有机质.
(2)倒去酸水,用自来水冲洗至中性.
(3)烘干,用40目筛子过筛,以去掉粗颗粒,备用.
(4)另取非耕作层的不含腐植质的瘦黄土或红土,加自来水浸泡洗涤数次,直至中性.
(5)烘干,碾碎,通过100目筛子过筛,以去除粗颗粒.
(6)按一份黄土、三份沙的比例(或根据需要而用其他比例,甚至可全部用沙或全部用土)掺合均匀,装入10×100mm的小试管或安瓿管中,每管装1g左右,塞上棉塞,进行灭菌,烘干.
(7)抽样进行无菌检查,每10支沙土管抽一支,将沙土倒入肉汤培养基中,37℃培养48小时,若仍有杂菌,则需全部重新灭菌,再作无菌试验,直至证明无菌,方可备用.
(8)选择培养成熟的(一般指孢子层生长丰满的,营养细胞用此法效果不好)优良菌种,以无菌水洗下,制成孢子悬液.
(9)于每支沙土管中加入约0.5ml(一般以刚刚使沙土润湿为宜)孢子悬液,以接种针拌匀.
(10)放入真空干燥器内,用真空泵抽干水分,抽干时间越短越好,务使在12小时内抽干.
(11)每10支抽取一支,用接种环取出少数沙粒,接种于斜面培养基上,进行培养,观察生长情况和有无杂菌生长,如出现杂菌或菌落数很少或根本不长,则说明制作的沙土管有问题,尚须进一步抽样检查.
(12)若经检查没有问题,用火焰熔封管口,放冰箱或室内干燥处保存.每半年检查一次活力和杂菌情况.
(13)需要使用菌种,复活培养时,取沙土少许移入液体培养基内,置温箱中培养.
此法多用于能产生孢子的微生物如霉菌、放线菌,因此在抗生素工业生产中应用最广,效果亦好,但应用于营养细胞效果不佳.
斜面低温保藏法
将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上,待菌充分生长后,棉塞部分用油纸包扎好,移至2-8℃的冰箱中保藏.
保藏时间依微生物的种类而有不同,霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2-4个月,移种一次.酵母菌两个月,移种一次.细菌最好每月移种一次.
此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法,优点是操作简单,使用方便,不需特殊设备,能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等.缺点是容易变异,因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的,屡次传代会使微生物的代谢改变,而影响微生物的性状;污染杂菌的机会亦较多.
液氮冷冻保藏法
(1)准备安瓿管用于液氮保藏的安瓿管,要求能耐受温度突然变化而不致破裂,因此,需要采用硼硅酸盐玻璃制造的安瓿管,安瓿管的大小通常使用75×10mm的,或能容1.2mm液体的.
(2)加保护剂与灭菌保存细菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的细胞时,则将空安瓿管塞上棉塞,1.05kg/cm2,121.3℃灭菌15分钟:若作保存霉菌菌丝体用则需在安瓿管内预先加入保护剂如10％的甘油蒸馏水溶液或10％二甲亚砜蒸馏水溶液,加入量以能浸没以后加入的菌落圆块为限,而后再用1.05kg/cm2>,121.3℃灭菌15分钟.
(3)接入菌种将菌种用10％的甘油蒸馏水溶液制成菌悬液,装入已灭菌的安瓿管;霉菌菌丝体则可用灭菌打孔器,从平板内切取菌落圆块,放入含有保护剂的安瓿管内,然后用火焰熔封.浸入水中检查有无漏洞.
(4)冻结再将已封口的安瓿管以每分钟下降1℃的慢速冻结至-30℃.若细胞急剧冷冻,则在细胞内会形成冰的结晶,因而降低存活率.
(5)保藏经冻结至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷冻保藏器的小圆筒内,然后再将小圆筒放入液氮保藏器内.液氮保藏器内的气相为-150℃,液态氮内为-196℃.
(6)恢复培养保藏的菌种需要用时,将安瓿管取出,立即放入38-40℃的水浴中进行急剧解冻,直到全部融化为止.再打开安瓿管,将内容物移入适宜的培养基上培养.
此法除适宜于一般微生物的保藏外,对一些用冷冻干燥法都难以保存的微生物如支原体、衣原体、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细胞均可长期保藏,而且性状不变异.缺点是需要特殊设备.
液体石蜡保藏法
(1)将液体石蜡分装于三角烧瓶内,塞上棉塞,并用牛皮纸包扎,1.05kg/cm2,121.3℃灭菌30分钟,然后放在40℃温箱中,使水汽蒸发掉,备用.
(2)将需要保藏的菌种,在最适宜的斜面培养基中培养,使得到健壮的菌体或孢子.
(3)用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡,注入已长好菌的斜面上,其用量以高出斜面顶端1cm为准,使菌种与空气隔绝.
(4)将试管直立,置低温或室温下保存(有的微生物在室温下比冰箱中保存的时间还要长).
此法实用而效果好.霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏2年以上不死,酵母菌可保藏1-2年,一般无芽孢细菌也可保藏1年左右,甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎球菌,在37℃温箱内,亦可保藏3个月之久.此法的优点是制作简单,不需特殊设备,且不需经常移种.缺点是保存时必须直立放置,所占位置较大,同时也不便携带.从液体石蜡下面取培养物移种后,接种环在火焰上烧灼时,培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅,应特别注意.