因为含维生素A原料中常常混有许多杂质，包括异构体，氧化降解产物，合成中间体，副产物等有关物质，且含有稀释用油，这些杂质在紫外区也有吸收，导致在维生素A吸收波长处测得的吸光度并不是维生素A独有的吸收，为了消除其他物质引起的误差，所以采用三点校正法。

　　三点波长的选择原则：一点选在维生素A的吸收波长处，其他的两点各在这一波长两侧选一点。这两点有两种选择方法，种是等波长差法，即吸收波长为328nm，左侧一点为316nm，右侧一点为340nm.这是10版药典规定测定维生素A醋酸酯的方法。第二种方法是等吸收比法，即左右两波长处的吸光度相等等于吸收波长处吸光度的七分之六。10版药典规定测定维生素A醇时用此方法。

　　1．原理

　　维生素A的异丙醇溶液在325 nm波长下有吸收峰，其吸光度与维生素A的含量成正比。本法的灵敏度较比色法高，可测定维生素A含量低于5?g／g的样品。主要缺点是在维生素A吸收波长325 nm附近许多其他化合物也有吸收，干扰测定，故本法适用于透明鱼油，维生素A的浓缩物等纯度较高的样品。对于一般样品，测定前必须先将脂肪抽提出来进行皂化，萃取其不皂化部分，再经柱层析除去干扰物。

　　2．仪器

　　紫外分光光度计; UV-1100;UV-1200。

　　3．试剂

　　①异丙醇。

　　②维生素A标准溶液：称取1 g相当于50 000国际单位维生素A的浓鱼肝油0．1000 g，加异丙醇溶解，定容至125 mL。此溶液1 mL相当于40国际单位(即40 IU．mL-1)。

　　4.测定步骤

　　①标准曲线绘制：分别取维生素A标准溶液(40 IU·mL-1)O．5、1．0、1．5、2．0、2．5、3．0、4.0 mL，于10 mL棕色容量瓶中，用异丙醇定容。以空白液调仪器零点，于紫外分光光度计上在325 nm波长下分别测定吸光度，绘制标准曲线。

　　②样品测定：称取适量样品，按照三氯化锑比色法进行皂化、提取、洗涤、浓缩、蒸发醚层后，迅速用异丙醇溶解并移人50 mL容量瓶中，用异丙醇定容，于紫外分光光度计325nm处测定其吸光度，从标准曲线上查出相当的维生素A含量。

　　5．计算X=[(c*V)/m]*100

　　式中：

　　X——样品维生素A的含量，IU·(100 g) -1；

　　c——由标准曲线查得的维生素A含量，IU·mL-1；

　　V——样品的异丙醇溶液体积，mL；

　　m——样品质量，g。

　　为何不直接以紫外可见分光光度法测定维生素A的含量,而要采用较为繁琐的三点校正法

　　牛胸腺DNA 钠盐溶液（pH = 7.0）ε（ρ）= 6 600,DNA 含磷量9.2%,含1μg/mL DNA 钠盐溶液光密度0.020.RNA 溶液（pH = 7.0）ε（ρ）= 7 700~7 800,RNA 含磷量9.5%,含1μg /mL RNA 溶液光密度0.022~0.024.采用紫外光光度测定核酸含量,通规定：260nm 波,浓度1μg/mL DNA 溶液其光密度0.020,浓度1μg/mL RNA 溶液其光密度0.024.,测定未知浓度DNA （RNA）溶液光密度OD260nm,即计算测其核酸含量.该简单、快速、灵敏度高,核酸3μg／mL 含量即测.于含微量蛋白质核苷酸等吸收紫外光物质核酸品,测定误差较,若品内混杂量述吸收紫外光物质,测定误差较,应设事先除.

　　由于降解或水解作用,核酸光密度增高约40％,众所周知增色效应（hyperchromic effect）.核酸,氢键π-键相互作用改变碱基共振行.,核酸光密度低于构核苷酸光密度,该现象称减色效应（hypochromic effect）.