共聚焦显微镜的工作原理是样品中的点激发（衍射极限点）和所得荧光信号的点检测。探测器上的针孔提供了阻挡离焦荧光的物理屏障。仅记录通风盘的对焦或中心点。光栅一次扫描一个样本允许通过简单地改变z焦点来收集薄的光学部分。可以堆叠所得到的图像以产生样本的3D图像。

激光扫描共聚焦显微镜与传统宽场显微镜相比，具有高清晰度、高分辨率、高灵敏度等特点，在生物医学领域应用广泛，成为了该领域重要的成像工具。为什么共聚焦能得到如此多的宠爱，它又有哪些优势呢？本文列举了三方面来论述共聚焦的优势。

只收集焦平面上的信号，使图像由模糊变清晰 图一是花粉颗粒的自发荧光图，由于样品比较厚，普通宽场荧光显微镜只能够观察到整体的样品结构，而共聚焦显微镜却可以完美的展现样品轮廓及内部结构。

那么共聚焦显微镜是如何实现这一优势的呢？这就要归功于共聚焦的关键硬件—针孔（pinhole），如图二所示，它是检测器前面的一个小孔，放置在与样品焦面共轭的光学平面上。当激发光照射样品时，焦面和非焦平面上的样品区域都会被激发而产生荧光信号，调节合适的针孔大小（通常为1 Au），使焦面上的荧光信号（绿色虚线）可以通过针孔到达检测器，而非焦平面的荧光信号（红色和蓝色虚线）不能通过针孔到达检测器。通过增加硬件针孔，使共聚焦在不改变普通荧光显微镜的制片方法的前提下，得到了清晰的高质量图像。

可连续获取不同焦平面的信号，实现三维重组

由于针孔的存在，我们能够只获取到焦平面上的信号，得到高分辨率的二维图像。连续调节Z轴位置，就能够得到不同Z轴位置的二维图像，获得一系列连续的“光学切片”图像。获得这些光学切片后，可使用仪器软件配备的3D模块进行三维图像的重组，构建出清晰的3D图像。这种无损伤的、连续的光学切片图像的采集，实现了“细胞CT”的功能。

下面我们来欣赏下花粉颗粒自发荧光光学切片序列图像（通常称为Z序列，图三），和它的三维合成3D图（图四）。 应用于共定位(Co-localization)研究

共定位结果的精准度与图像的分辨率密切相关，所以我们在进行共定位实验时需要选择更高分辨率的成像方式。共聚焦显微镜相比于传统显微镜以其高分辨率的优势，成为共定位研究的得力工具。

由于衍射极限的存在，常规共聚焦光学分辨率在200nm左右，当我们需要观察大于200nm的结构时，共聚焦就能够准确判断其共定位程度。如果需要进行共定位分析，可以选用共聚焦软件中配备的共定位分析模块。