通常配制卡尔费休试剂时只有碘应严格依照化学计量，其它组分则是过量的，一般采用的摩尔比为碘：二氧化硫：吡啶：甲醇=1：3：10：50。配制卡尔费休试剂所用各物质必须严格控制其含水量，一般不得超过0.1%，若进行微量分析时，不应超过数个ppm。



　　配制步骤：取无水吡啶133mL与碘42.33g，置入具塞棕色试剂瓶中，振摇至碘全部溶解后，加入无水甲醇333ml。精确称量试剂瓶重，通入经浓硫酸脱水的二氧化硫气体至试剂瓶增重32g，将瓶塞塞牢、摇匀，于暗处放置48h后标定。依此配制的卡尔费休试剂的滴定度约为含水3-5g/mL。当使用专用试剂瓶时，可在通二氧化硫至增重32g时，把液面的位置作一标记，以后每次配制，只需取一定量的各物质置入试剂瓶中，通入二氧化硫气体，使试剂溶液掖面升高至标记处即可，这样可省去费时的称重操作。



　　为使卡尔费休试剂稳定，有另一种配制方法，即先配成二组溶液，在使用前混合。一组为碘和甲醇溶液I；另一组为二氧化硫和吡啶溶液II。



　　溶液I：取碘63g，置入试剂瓶中，加366mL无水甲醇，括至碘全部溶解。



　　溶液II：取100mL无水吡啶，置入试剂瓶小，准确称量，然后通入干燥的二氧化硫气体，使其增重32g。



　　新配制的卡尔费休试剂很不稳定，随放置时间增加，浓度逐渐降低。在前二、三日内，滴定度有显著下降，以后降低缓慢，一周以后，滴定度每日约减少1%，之后则变化更趋缓慢。滴定度开始迅速下降的原因主要是试剂中各组分所含残存水分的作用，随后滴定度缓慢下降的原因则是副反应的影响。